elisa技术在抗体检测中的应用

elisa技术在抗体检测中的应用

酶联免疫吸附试验是目前检验检疫中常见的免疫检查方法之一。它的手术简单，无需特殊设备，因此在各级医院都可以使用。但是,如果忽视了影响其结果的因素,难免造成假阴性或假阳性,现对影响实验结果的常见影响因素及控制方法探讨如下。1试剂的原因2样本的要素2.1内源性干扰因素：包括油流因素r、补体、浓度较高的非特异性免疫球蛋白、异质性抗体、某些自身阻力2.2外源性干扰因素：包括样品溶血、样品被细菌污染、样品储存时间长、样品硬化等3操作中的技术要素3.1加酶带试剂量不确定孵育前加样时间过长,酶试剂加出孔外,使用滴瓶滴加试剂时,滴加的角度不同和挤压的力度不同,致使滴加的试剂量不准,都可导致试验结果不准确。控制方法:(1)实验样本过多时,可分批次操作,以减少实验时间延长造成的误差;(2)加酶试剂后,用吸水纸吸干孔外试剂;(3)作定量试验时,使用加样器加注试剂,并经常校正其准确性,此外,要做到一份样本一个移液头,防止交叉污染。3.2温育3.3抽吸不完全,清洗不规范ELISA测定的洗板一般有两种方式,即手工和洗板机洗板。采用手工洗板,孔与孔之间液体易交叉,采用半自动洗板机时,洗液量不足导致洗板不彻底,洗板针堵塞导致抽吸不完全,洗板不畅导致清洗效果差。控制方法:(1)手工洗板时,拍板时要垂直,避免交叉污染,用力不能过猛,防止抗原抗体复合物脱离;(2)洗板机洗板时应经常检查冲洗头是否通畅,若被杂物堵塞时可用注射器针头挑出;(3)为了洗涤效果好,实验室可采用机器与人工洗涤相结合的方法,在机器洗涤后再进行人工洗板1~3次,或适当增加洗板的次数,有资料报道洗板7次能达到理想的洗涤效果。3.5elisa测定的程序及方法读取结果要在15~30分钟内完成,定性测定用肉眼判读试验结果时,反应板应水平距离白色背景10~15分钟;定量测定时用酶标仪读取结果,酶标仪不应置于阳光或强光下,需先预热15~30分钟再进行测试。综上所述,尽管ELISA法操作简单,但可能影响测定结果的因素也较多。故在实际操作的过程中,要加强质量管理,排除各种影响因素干扰,力求结果准确,为临床疾病的诊断和科研提供可靠的依据。1.1试剂的选择:试剂的选择是保证血液检测质量的关键因素。虽然国家采用批批检定的形式对ELISA试剂严格把关,但不同厂家的试剂在使用效果上存在一定的差别。要选知名度相对高、具有“三证”的试剂,不要用无批号的试剂,更不要使用过期的试剂和混用不同批号的试剂。1.2在临床实验室,对试剂的准备一般不太注意,通常的做法是在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用,这种做法的直接后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此,在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是,将试剂盒先从4℃冰箱中拿出来,在室温下放置20~30分钟后,再进行测定,使试剂盒在使用前与室温平衡,这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度,以满足后面的测定需求。2.1.1类风湿因子在类风湿患者及正常人血清中,常含有较高或不同浓度的类风湿因子,其一般为IgM型,具有与变性IgG产生非特异性结合的特点,因为在ELISA测定中,其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的特异抗体IgG结合,从而出现假阳性结果。避免出现此现象的方法有:(1)用F(ab)2替代完整的IgG。(2)标本用联有热变性IgG的固相吸附剂处理。(3)检测抗原时,可用2-巯基乙醇加入到标本稀释液中使RF降解。2.1.2补体在固相酶免疫测定中,来自哺乳动物的固相抗体和酶标二抗均有激活人补体系统的功能。一方面,固相抗体和酶标二抗可因其吸附及结合过程中抗体分子发生变构,使Fc段的补体C1q结合点暴露出来,使C1q将二者连接起来出现假阳性结果另一方面,固相抗体因为活化补体的结合,封闭抗体和抗原的表位结合能力而引起假阴性。解决的方法是:(1)用EDTA稀释标本(2)56℃30分钟加热血清使C1q灭活。2.2.1标本的溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净,残留在孔内的血红蛋白有类过氧化物酶样的活性,催化底物显色造成假阳性。采集血液时勿用力振荡,严防标本溶血。2.2.2标本的污染菌体可能含有内源性辣根过氧化物酶,可使实验出现非特异性显色。因此,ELISA检测宜采集新鲜标本,如不能当时测定,5天之内应4℃保存,1周后检测应低温冻存;同时,收集标本采用无菌试管,可防止标本的污染。2.2.3标本的保存:标本在冰箱中保存过久,血清中IgG可聚集成多聚体,AFP可形成二聚体,在用间接法测定中导致本底过深,甚至造成假阳性。冰冻保存的标本反复冻融产生机械切力对标本中的蛋白等分子有破坏作用,可引起假阴性结果。因此,ELISA检测尽量采用新鲜标本,长时冻存的标本避免反复融冻。2.2.4标本凝固不全:凝固不全的血清中含有部分纤维蛋白原,可使结果呈假阳性。解决的反方法有:(1)标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的抗凝剂;(2)血液标本采集后必须充分凝固后再离心分离血清。3.2.1温育时间、温度的选择一般根据试剂盒的说明书选择温育的时间、温度。加完样本和(或)试剂后将微孔板从室温放入水浴箱或温箱中时,孔内温度从室温升至37℃需要一定时间,如果是将微孔板一放入温箱即开始计时,这样就容易造成实际测定中温育时间不够,易致弱阳性标本测不出来。控制方法:(1)如有两种温度,尽量使用较低的温度、较长反应时间的条件;(2)用1个小温度计放置在板孔反应液中测量观察。3.2.2“边缘效应”的排除“边缘效应”是在使用96孔板的ELISA测定中,外周孔显色较中心孔深的现象。产生的原因可能是96孔板周围孔与中心孔在温育中的热力学梯度造成的,因此在温育时尽量采用水浴。3.4邻苯二胺odp为底物的试剂市售ELISA试剂盒中,如以四甲基联苯胺(TMB)为底物,则提供的底物为A和B两瓶应用液;如以邻