大肠埃希菌质粒头孢菌素酶基因的初步研究

大肠埃希菌质粒头孢菌素酶基因的初步研究

酶c最初是由抗氨基丙烯酸苯磺酸盐的埃希菌引起的，然后在许多革兰氏阴性杆菌中发现了由染色体诱导的磺c酶c。近十多年来,不断在质粒上发现表达各种AmpC酶的基因。本研究调查我院大肠埃希菌中质粒介导型AmpC酶基因型的分布情况,报道如下。1材料和方法1.1菌株的质控指标收集2005～2006年中南大学湘雅三医院住院病人中分离的大肠埃希菌157株。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603,产TEM-1、SHV-1、CTX-M-3、DHA-1、ACT-1型β-内酰胺酶的菌株作为对照,由上海瑞金医院临床微生物科提供。1.2培养基和试剂抗生素纸片:头孢他啶(30μg/片),头孢噻肟(30μg/片),头孢噻肟/克拉维酸(每片30μg/10μg),头孢他啶/克拉维酸(每片30μg/10μg),头孢西丁(30μg/片)及M-H培养基均为英国Oxoid公司产品。阿米卡星(AMK),阿莫西林/克拉维酸(AMC),氨曲南(AZN),头孢唑啉(CFZ),头孢吡肟(FEP),头孢哌酮/舒巴坦(CFS),头孢噻肟(CTX),头孢他啶(CAZ),头孢呋肟(CXM),环丙沙星(CIP),头孢西丁(FOX),左氧沙星(LVX),哌拉西林(PIP)由中国药品生物制品检定所提供。亚胺培南(IMP)为杭州默沙东公司提供。1.3ss基因编码区的处理根据GenBank收录的质粒型ampC基因和ESBLs基因序列信息,采用PrimerPremier5.0软件包辅助设计,选择各型ampC基因和ESBLs基因编码区(CDS)保守序列设计通用引物。各型ampC基因和ESBLs基因PCR扩增片段涵盖其大部分CDS及主要氨基酸替代位点,以便于亚型区分。扩增ampC基因设计5对通用引物,ESBLs基因设计TEM、SHV、CTX-M型3组通用引物,见表1。各引物均由上海生工生物工程公司合成。质粒抽提试剂盒、PCR纯化试剂盒均为上海生工公司产品。PCR仪为AppliedBiosystems公司GeneAmpPCRSystem9700。1.4最低抑菌浓度测定根据2005年美国临床实验室标准化研究所(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI/NCCLS)出版的药敏试验指南,用琼脂稀释法测定13株CMY-2组和1株DHA-1组PCR扩增阳性菌株对14种抗生素的最低抑菌浓度(MIC)。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。1.5报道方法及结果采用K-B法,用FOX纸片检测受试菌株,抑菌圈直径≤17mm提示对FOX耐药或中介者为疑产AmpC酶株,确证试验参照Coudron报道方法进行。阴沟肠杆菌029M为阳性对照,肺炎克雷伯菌ATCC700603为阴性对照。1.6pcr模型准备对24株耐头孢西丁菌株按质粒抽提试剂盒说明书提取细菌质粒。以质粒作为PCR模板。1.7dntp反应以上述24株菌株的质粒作模板,进行PCR,反应体系为PCRPremix(TaKaRa,日本)25μl(含TaKaRaTaq1.25U,dNTP各0.4mmol/L,Mg2+3mmol/L),primerF1μl(20μmol/L),primerR1μl(20μmol/L),质粒DNA模板3μl,ddH2O20μl,反应终体积50μl。反应条件为:94℃预变性3min,然后进入PCR循环,94℃变性35s,58～60℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环,最后72℃延伸5min。1.8凝胶纯化产物的测序用琼脂糖凝胶电泳法,PCR产物在含0.5μl/ml溴乙锭的15g/L琼脂糖凝胶中电泳,用凝胶成像系统观察结果,照相后切胶回收纯化。纯化产物直接测序,测序仪器为ABIPRISM3730,同一样品经正、反测序。所测序列采用DNAstar软件进行序列拼接、校正和氨基酸序列的推导,并与GenBank数据库提供的质粒型AmpC酶核苷酸序列进行对比以确定其基因亚型。1.9试验结论13株CMY-2组和1株DHA-1组PCR扩增阳性菌株进行接合实验,步骤参照文献进行。2结果2.1产酶基因的检测结果157株中对FOX抑菌圈直径≤17mm共计24株。其中三维实验阳性者共计16株。2.2esbl基因型检测24株菌株采用通用引物扩增阳性组有:CMY-2组和DHA-1组。其中CMY-2组有13株(图1):EC0501、0504、0512、0517、0519、0520、0543、0545、0550、0554、0562、0578、0583。DHA-1组有1株:EC0546。ESBL基因型检测TEM组有15株阳性:EC0501、0504、0512、0517、0519、0520、0542、0543、0545、0546、0550、0554、0562、0578、0583;SHV型1株阳性:EC0546;CTX-M型有2株阳性为EC0543和0554。2.3gebak比对的比对13株扩增CMY-2组阳性者产物经测序,结果为一新的CMY型AmpC酶,与GenBank的比对发现,最接近的是EscherichiacoliAmpC-EC8(bla(ampc-EC8))gene(DQ092427.1),有98%的同源性。DHA组EC0546测序结果为DHA-1型。2.4一般实验菌株EC0543,EC0583和EC0546接合成功。提取质粒后,PCR扩增出预期大小的片段(852bp)。2.5合成对头孢他嗪的耐药率14株产AmpC酶的大肠埃希菌对第一代、第二代头孢菌素头孢唑啉和头孢呋肟的耐药率达100%,对第三代头孢菌素头孢他啶耐药率达42.9%,头孢噻肟耐药率达100%;对氨曲南、头孢西丁也全部耐药;对含酶制剂哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、左氧沙星、环丙沙星有不同程度耐药;对阿米卡星和第四代头孢菌素头孢吡肟耐药率相对较低,对亚胺培南则全部敏感。3内标物质粒携带特性与抗菌药物耐药的关系20世纪90年代以前认为AmpC酶由染色体介导产生,自1990年Papanicolaou等人第一次证实了肺炎克雷伯菌携带编码AmpC酶-MIR-1质粒后,质粒介导的AmpC酶在世界各地以大约每年增加一种的速度不断被发现,目前已超过40多种。与染色体介导的AmpC酶不同,质粒介导的AmpC酶高水平持续表达,且可通过转化、接合等方式转移给其他菌种,造成耐药性的广泛传播。不同国家质粒介导的AmpC酶种类有所不同。在国内临床分离株中所产的ampC基因以DHA型和CIT型为主,而我们发现的CMY类似AmpC酶的发生率约8.28%(13/157),这13株中,都同时产TEM型ESBLs,有1株产SHV型,2株同时产CTX-M型ESBLs。这13株大肠埃希菌通过测序并在GenBank中比对,发现与之最近的是EscherichiacoliAmpC-EC8(bla(ampc-EC8))gene(DQ092427),有98%的同源性,但有多个核苷酸序列的改变,如318位C→T,448位G→A,469位A→T,489位G→T,532位A→G,772位G→C等,所以它应该是GenBank里目前还不曾登录的基因序列,数据正向GenBank提交。在14株大肠埃希菌和携带有同样性质的3株接合子扩增出了费氏枸橼酸杆菌染色体来源的CMY型ampC基因片段和摩氏摩根菌群来源的DHA型ampC基因片段。由于接合子受体菌本身不带有染色体来源的ampC基因片段,所以接合子扩增