柞树提取液遗传毒性的研究

柞树提取液遗传毒性的研究

棕榈叶是指经过加工的次生林木本植物。它有多种用途，在中国广泛分布。柞树提取液也有相当的医用价值,对治疗鱼类黑斑及体表各种溃烂有特效,而对治疗人的烧伤、烫伤、外伤以及动物咬伤有奇效,且无遗留瘢痕,对昆虫咬伤、青春痘以及其他原因引起的人表皮炎症性、感染性和化脓性疾病也有显著疗效。柞树提取液作为一种新产品,需要对其安全性进行毒理学评价。本研究采用小鼠骨髓微核实验、小鼠精子畸形实验、Ames实验和V79基因突变实验对柞树提取液的遗传毒性进行了研究。1材料和方法1.1材料和实验仪器组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌TA97,TA98,TA100和TA102,由原卫生部食品检验所提供,本实验室保存。柞树提取液(Bristletoothoakextract)采取燃烧柞树树枝,排出的气体冷凝回收,再经发酵后蒸馏提取而成,为水溶性成分,由杭州001生物科技有限公司提供;中国仓鼠肺(V79)细胞株由中科院细胞库提供;0.25%胰酶溶液Ⅸ(吉诺生物医药技术有限公司);Hyclone磷酸盐缓冲液(赛默飞世尔生物化学制品有限公司);Hyclone改良型RPMI1640培养液(赛默飞世尔生物化学制品有限公司);甲基磺酸乙酯和6-巯基鸟嘌呤由Sigma公司提供;代谢活化剂大鼠肝匀浆S-9混合液,营养肉汤培养基,营养肉汤琼脂培养基,底层、顶层培养基等都是在本实验室现配现用。其他试剂均为分析纯。净化工作台(苏州集团苏州安泰空气技术有限公司);CO2培养箱(美国Shecab公司);倒置显微镜(德国Leica公司);CYT-1000型细胞计数仪(浙江省科学器材进出口责任有限公司);电热恒温水槽(上海森倍实验仪器有限公司);5810R型高速离心机(德国埃本德公司);SS-325型高压灭菌器(日本Tomy公司);MDF-U32V型低温冰箱(德国Sanyo公司)等。组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌TA97,TA98,TA100和TA102,由原卫生部食品检验所提供,本实验室保存。1.2温度、湿度ICR小鼠,由浙江省实验动物中心提供,动物生产许可证号:SCXK(浙)2008-0033,清洁级,雌雄各半,体质量25～35g。温度20～23℃,相对湿度55%～70%。小鼠实验前在动物房环境中适应3d。染毒前,禁食过夜,不限制饮水。1.3全覆盖回变菌落实验实验采用平板掺入法。用4株菌株的非代谢活化系统进行预试,在柞树提取液100mg(为标准最高剂量的20倍)时未出现毒性作用。故正式实验时选择柞树提取液6.25,12.5,25,50和100mg。最高剂量用原液直接测试,其他剂量分别称取样品原液625,1250,2500和5000mg加灭菌蒸馏水至10ml,充分混匀,实验时每培养皿加0.1ml。同时设正常对照组、溶剂对照组(蒸馏水)和2-氨基芴阳性对照组,每种菌株每个测试浓度设三皿平行,在加S9和不加S9条件下进行实验。直接计数培养基上各菌株的回变菌落数。有阳性结果重复测试一次。1.4集落形成率测定参照GB15193.12-2003。根据预实验结果选用10g·L-1(相当于每瓶细胞加100mg,为标准最高剂量的20倍)作为最高浓度。柞树提取液2.5,5.0和10g·L-1组10μl培养液中分别加入柞树提取液25,50和100mg,同时设正常对照组(不含血清的培养液)和甲基磺酸乙酯(EMS)阳性对照组(终浓度0.4g·L-1)。直接观察集落数,并按下列公式计算:绝对集落形成率=形成集落数/接种集落数×100%;相对集落形成率=绝对集落形成率(实验)/绝对集落形成率(对照)×100%;突变频率=(突变集落数/接种细胞数)×(1/绝对集落形成率)。1.5环磷酰胺阳性对照参照GB15193.5-2003。小鼠50只,雌雄各半,随机分成5组,每组10只。小鼠ig给予柞树提取液2.5,5.0和10.0g·kg-1,第1次给药后24h再给予1次,观察30h。另设正常对照(蒸馏水)和环磷酰胺60mg·kg-1(阳性对照)组。给药后6h脱颈椎处死,每只小鼠取两侧股骨髓,制片,细胞涂片置显微镜下观察,每只小鼠计数1000个嗜多染红细胞,计算微核千分率(‰)。柞树提取液组与对照组相比,微核率有明显的剂量反应关系并有统计学意义时,即可确认为阳性结果。1.6小鼠精子畸形试验参照GB15193.7-2003。另取小鼠25只,雄性,随机分成5组,每组5只。小鼠ig给予柞树提取液2.5,5.0和10.0g·kg-1组(按10ml·kg-1给药,蒸馏水配制),每天1次,连续5d,另设正常对照(蒸馏水)和丝裂霉素C2.0mg·kg-1阳性对照组。小鼠最后给药30d后脱颈椎处死,取出其双侧附睾放入生理盐水离心管中,制片,高倍镜下检查精子形态,每只小鼠检查完整精子1000个,记录畸变精子类型(如无钩、胖头、香蕉状、双头尾、折叠和无定形)和数目,计算精子畸形率(%)。精子畸形阳性的标准是畸形率至少为阴性对照组的倍量或经统计学处理有显著性意义,并有剂量反应关系。1.7统计分析实验结果数据以x¯±sx¯±s表示。应用软件SPSS15.0进行数据处理,采用秩和检验和泊松(Poisson)检验进行统计学分析。2结果2.1回复突变实验结果柞树提取液Ames的实验结果见表1,可见柞树提取液不同剂量在加S9和不加S9条件下的回变菌落数均未超过溶剂对照组回变菌落数的2倍,Ames实验结果为阴性。2.2率50%以上的实验要求柞树提取液V79基因突变实验各组集落形成率见表2,受试物各组集落形成率均较阴性对照低,但满足细胞成活率50%以上的实验要求。柞树提取液V79基因突变实验各组突变频率如表3,阳性对照突变频率为阴性对照的5倍以上,而柞树提取液组突变频率均未达到阴性对照组3倍以上的阳性标准,其中,柞树提取液2.5和10mg加S9的与不加S9的组相对于阴性对照组的突变频率的比值均在1.5以上,但未见明显的剂量反应关系。2.3棕榈提取物对大鼠骨细胞微核率的影响柞树提取液小鼠微核率如表4所示,用泊松检验统计,柞树提取液各剂量组微核率和阴性对照组,差异均无显著性,小鼠微核实验结果为阴性。2.4小鼠精子畸形试验柞树提取液小鼠精子畸形率如表5所示,柞树提取液各剂量组精子畸形率和阴性对照组比较,经秩和检验统计,差异均无显著性,提示小鼠精子畸形实验结果为阴性。3小鼠骨髓微核实验、小鼠精子畸形实验和v7基因突变实验随着遗传毒理学相关领域特别是分子生物学的研究进展,遗传毒性测试评价方法也在不断改进。据报道,目前已建立的短期检测法已超过200种,但真正经过验证有合适灵敏度和特异度的大概不到10种。根据其检测的遗传学终点可分为4种类型:①检测基因突变,②检测染色体畸变,③检测染色体组畸变,④检测DNA原始损伤。其中,遗传毒性最常规的检测方法有小鼠骨髓微核实验、小鼠精子畸形实验和Ames实验等。小鼠骨髓微核实验在检测的遗传学终点上属于检测染色体畸变实验,而小鼠精子畸形实验属于基因突变实验。柞树提取液的精子畸形率和小鼠微核率实验显示各剂量组与对照组相比,差异均无显著性,表明未见柞树提取液对哺乳动物体细胞和生殖细胞有遗传毒性。此外,PCE/RBC作为细胞毒性的指标,比值小于0.1提示对骨髓具有明显的抑制作用,应降低受试物剂量,重新进行实验。本研究中各剂量组PCE/RBC均大于0.6,符合标准要求。Ames实验根据遗传学终点分属于基因突变,它是检测环境诱变剂一组实验中的首选实验,广泛应用于致突变化学物的初筛。预实验的结果显示100mg剂量条件下未见抑菌现象,故正式实验时选择6.25,12.5,25,50和100mg组进行,结果以直接计数培养基上长出回变菌落数的多少而定,如在背景生长良好的条件下,受试物组回变菌落数增加一倍以上(即回变菌落数等于或大于2乘以未处理对照数),并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重复的并有统计学意义的阳性反应,即可认为该受试物诱变实验阳性。本研究结果显示虽然最高剂量为每皿100mg在加S9的条件下TA102回变菌落有些偏高,但所有剂量组均未达到溶剂对照组的2倍升高的标准,因此结果为阴性。V79基因突变实验的遗传学终点是真核细胞基因突变,在近些年来常被应用于评价新产品的安全性,也常用于遗传毒理学研究和筛选诱变剂工作。根据突变集落数,计算突变率以判定受试物的致突变性。根据预实验结果,染毒剂量为10.0g·L-1条件下培养的V79细胞显示有较多的死亡的现象,以此为最高剂量下设2.5和5.0g·L-1进行V79基因突变实验。结果显示阴性对照集落形成率在90%以上,最高剂量集落形成率在50%以上,表明本研究剂量设置满足V79基因突变实验的实验要求。阳性对照的突变率显著高于阴性对照,与文献报道一致。当突变率为自发突变率的3倍或3倍以上,或至少3个浓度范围内,突变率有随浓度升高而增加的剂量反应关系时,可判为阳性。本研究最高突变率为2.2,除低剂量组在加S9条件下突变率低于阴性对照组外,其余各剂量组均高于阴性对照组,但未见明显的剂量反应关系,因此本研究结果未达到阳性标准。在一定的