复旦大学化学AII第十章液相色谱

第21章液相色谱分析法2023/9/14一.HPLC与GC的区别流动相分别为液体和气体：扩散系数Dm液/Dm气=10-5

速率方程H=A+B/v+CvA（涡流扩散项）∝dpB（分子扩散项）忽略不计C（传质阻力项）∝dp2v∝1/dp2023/9/14填充柱气相色谱柱，填料尺为80-100目(2毫米);高效液相色谱的固定相粒度在2－10微米,因此需要很高的反压。高效液相色谱（HPLC）又称为：高速液相HSLC高压液相HPLC

高分辨液相HRLC2023/9/14HPLCGC分析对象70%-80%化合物20-30%气体和无机、有机流动相液体（与组分有作用）气体（化学惰性）柱温低温、室温高温流动相产生高压泵+贮液瓶高压钢瓶进样进样器直接进样柱形直型螺旋型载体粒子2－10um2mm柱长10cm-25cm＞1m高压液相色谱与气相色谱的比较2023/9/142023/9/14二.高效液相色谱法的特点

featureofHPLC

特点：高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。2023/9/14三.液相色谱类型

固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等。

流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。

基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；

吸附色谱对中等分子量的油溶性样品可获得最佳的分离，适用于异构体分离和同系物分离；而对强极性或离子型的样品，有时会发生不可逆吸附，不能得到满意的结果。

缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；1.液-固吸附色谱

liquid-solidadsorption

chromatography2023/9/141.被测组分性质（极性大小）：

烃＜--------＜羧酸，醇2.吸附剂的活性：吸附剂的活性↑大，对被测组分的吸附能力↑强

强极性物质——选择弱吸附剂（固体固定相）弱极性物质——选择强吸附剂（固体固定相）3.流动相的选择：“相似相溶”原则

基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。

吸附剂和流动相的选择：

依据被测组分、吸附剂和流动相的性质2023/9/14极性吸附剂上有机化合物的保留顺序如下（极性强保留时间长）：氟碳化合物<饱和烃<烯烃<芳烃<有机卤化物<醚<硝基化合物<腈<叔胺<酯醛酮<醇<伯胺<酰胺<羧酸<磺酸2023/9/142.液-液分配色谱

liquid-liquidpartition

chromatography固定相与流动相均为液体（互不相溶）；

基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；

流动相：

正相色谱(normalphase)：流动相极性比固定相极性小反相色谱(reversephase)：流动相极性比固定相极性大

固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；

化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。2023/9/14液固色谱的固定相与气固色谱的相类似，但粒子更小。液液色谱的固定相：化学键合的固定相——载体+固定液(1).固定相的载体a、硅胶⑴无定形全多孔硅胶YWG⑵球形全多孔硅胶YQG⑶堆积硅珠YQG

b、高分子多孔微球YSG(1).液液色谱的固定相2023/9/14(2).固定相的化学键合化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳键型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—

C

稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；

c.硅碳键型：≡Si—C

d.硅氮键型：≡Si—N2023/9/14(3).化学键合固定相的特点（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；

2023/9/14(4).正相键合相色谱法的分离条件固定相：极性键合相，如氨基、氰基适应对象：极性化合物，如氨基、氰基、糖类多官能团化合物流动相：烷烃加适量极性调节剂（二氯甲烷＋甲醇）

出峰次序：极性小先出峰2023/9/14(5).反相键合相色谱法的分离条件固定相：非极性键合相如ODS适应对象：非极性或极性分子型的化合物，如短链烷和苯基化合物流动相：极性最强的水作基础溶剂，加入甲醇、乙腈、四氢呋喃等极性调节剂

出峰次序：极性大先出峰

2023/9/14（6）、正反相键合相色谱法的比较反相键合相正相键合相固定相非极性如十八烷基键合相（ODS）极性如氨基、氰基键合相流动相极性（甲醇-水、乙腈-水）非极性（烷烃+适量极性调整剂）分离机制疏溶剂理论范德华力流动相极性与k的关系流动相极性越大，洗脱能力越小，则k越大，tR越大流动相极性越大，洗脱能力越大，k、tR均越小组分出峰顺序极性大先出峰极性大后出峰应用非极性至中等极性极性化合物2023/9/14(7).液液色谱法的流动相(a).基本要求：1、不与固定相发生化学反应2、对样品有适宜溶解力3、必须与检测器相适应——如紫外4、粘度小5、沸点适中6、色谱纯7、避免会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂（pH2-8）2023/9/14(b).流动相分类

按流动相组成分：单组分和多组分；

按极性分：极性、弱极性、非极性；

按使用方式分：固定淋洗和梯度淋洗。

常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2023/9/14(c).流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。反相液-液分配分离，也可类似操作。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。

常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)2023/9/14四、液相色谱仪器

highperformanceliquidchromatograph2023/9/14液相色谱仪（2）2023/9/14液相色谱仪（3）2023/9/14液相色谱仪（4）2023/9/141、主要部件

MainassemblyofHPLC(1).流程2023/9/14(2).液相色谱检测器

a.紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：

灵敏度高:10-10g/ml线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；

对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。

2023/9/14光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。2023/9/142023/9/14光电二极管阵列检测器2023/9/14b.示差折光检测器

（differentialrefractiveindexdetector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低(10-7g/ml)、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；2023/9/14示差折光检测器2023/9/14c.荧光检测器

（fluorescencedetector）高灵敏度(10-12g/ml)、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；2023/9/14(3).高压输液泵主要部件之一，压力：20-80大气压。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性2023/9/14气相色谱分离条件：1.柱温；2.气体压力、流速程序升温2023/9/14(4).梯度淋洗装置外梯度:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。2023/9/14(5).进样装置

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：2023/9/14(6).高效分离柱