雨生红球藻培养条件及培养条件对虾青素的影响

雨生红球藻培养条件及培养条件对虾青素的影响

红芽藻类是生活在淡水中的绿色植物。根据特殊情况，可以积累大量类毒素（可达干重2%5%）。80%以上的虾青素及其酯类虾青素被广泛用于水产养殖。根据近年来的研究，虾青素具有许多重要的生理和生物学功能，如抗旱性、肿瘤性和革兰氏性。它在食品添加剂、保健品、佐剂和医药行业中具有广阔的应用前景。雨生红球藻的生活周期主要分为营养细胞和厚壁孢子.一般认为环境有利时,主要以绿色、能运动的藻体形式存在;环境不利时,形成厚壁孢子并大量累积虾青素.因此雨生红球藻的营养生长与虾青素累积所需的条件是不同的.本文分别就雨生红球藻培养过程中营养生长阶段和虾青素累积阶段若干因素进行研究,希望为雨生红球藻的大规模培养和开发利用提供实验基础.1材料和方法1.1藻类与基本繁殖条件雨生红球藻HB712,藻种由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供.所有培养均以BBM为基本培养基.BBM培养基组分见文献.1.2显光照培养箱CARY50BIO紫外-可见分光光度计;150C数显光照培养箱(江苏省金坛市荣华食品有限公司);YSJ-2高速离心机(广州国华电器厂);LD-42低速离心机(北京医用离心机厂);JD-3照度计(上海市嘉定学联仪表厂).1.3实验方法12细胞计数按照金传荫等的方法,用“浮游生物计数框”进行细胞计数.2计算生长速率的比率根据普通微生物学通用公式计算.32虾青素含量测定参照文献的方法,进行色素的提取和测定.2结果与分析2.1雨生红球藻叶绿素吸收峰的确定藻细胞对数生长培养物经充分振荡混匀后,置CARY紫外-可见分光光度计扫描可见光谱吸收曲线,仅在681nm处存在一明显吸收峰,这是雨生红球藻藻体内叶绿素的吸收峰.二者在光密度0.1～1.1满足线性关系:O.D681=2×10-6N+0.0327.其中N表示雨生红球藻游动细胞密度(个/mL).最小方差R2=0.9891,相关系数显著,因此可利用培养物在681nm波长处的OD值来测定细胞密度.2.2不同温度对雨生红球藻细胞生长的影响采用BBM培养基,在pH为8.0,光照强度为1000lx,24h连续光照条件下,试验温度设置为18、21、24、27、30℃,测定温度对雨生红球藻生长速率的影响.结果如图1.细胞生长速率在24℃以下随温度的升高而增大,但超过24℃后生长速率随温度的上升而降低,24℃下生长速率达到0.251d-1.镜检结果表明,27℃和30℃组在培养5d后原来绿色游动细胞转为不动细胞,细胞内出现少量虾青素累积.而24℃以下各组直至培养结束(第10天)才出现部分游动细胞转化成不动细胞.因此,较低的温度有利于雨生红球藻保持较长的生长周期以及较高的生长速率.从试验结果来看,24℃左右较适合雨生红球藻细胞数目增长,细胞生长速率达到0.251d-1.2.3ph值对雨生红球藻细胞生长的影响用NaOH调节BBM培养基的pH分别为6.0,7.0,8.0,9.0,10.0.培养物置于23℃下恒温培养,光照强度为1000lx.每日定时取样测定藻体吸光度并添加少量NaOH维持恒定pH值.不同的pH值条件下雨生红球藻细胞生长曲线如图2所示.从图2可知,在不同的pH值下,前4d藻的生长没有明显差距,从第5天开始一直到培养结束(第10天),差别开始增大.其中以pH=8.0为最适合雨生红球藻生长的pH,在实验设置的条件下,ρ细胞密度在培养的第10天达到4.18×105个·mL-1.并且在pH=10.0的情况下,雨生红球藻只能维持6d的细胞增长,6d后细胞数目开始减少,镜检发现细胞大多数转为不动的孢子态.2.4不同光照模式对雨生红球藻生长的影响采用BBM培养基,23℃恒温培养,光照强度设置500、1000、1500、2000、2500lx.光照模式设置:24h连续光照和12∶12光暗光亮周期.结果如图3所示.光照强度为500～1500lx,24h连续光照下,雨生红球藻的生物量随光照强度的增加而增加,细胞密度从500lx光照强度下的2.42×105个·mL-1增加至1500lx光照强度下的3.26×105个·mL-1.光照强度超过1500lx,生物量随光照强度的增加反而降低,2500lx光照强度下细胞密度仅达到1.46×105个·mL-1.镜检发现在2000～2500lx高光强下,24h的连续光照导致大量藻在培养7d后从游动细胞向不动细胞转化,故生物量增长低.而在12h∶12h光暗周期下,雨生红球藻在500～2500lx范围内,生物量均随光照强度的增加而增加.从不同的光照模式比较,较低的光照强度(1000～1500lx)连续光照优于较强的光照强度12h∶12h光暗周期.在研究了雨生红球藻fachb-712株适宜生长温度、光照强度、光照周期和pH条件,故采用24℃,1000lx连续24h光照,pH控制在8.0附近,培养周期为10d,雨生红球藻fachb-712株平均生长速率达到0.252d-1,高于叶勇等报道的雨生红球藻712株平均生长速率0.137d-1.2.5正交试验结果适宜条件培养10d后的雨生红球藻培养物经离心,藻种团接种于不同NaNO3、FeSO4、乙酸钠浓度的BBM培养基中.温度控制在30±0.5℃,初始接种pH=8.0,光照强度提高至5000lx,连续光照.连续培养10d,隔日定时取样测定培养物虾青素含量.据文献报道,高光强、高温、营养盐(氮、磷)缺乏、盐(NaCl、NaAc等)胁迫和氧化压力(活性氧、氧自由基和溶解氧)等许多环境条件都可以诱导雨生红球藻细胞内虾青素的累积.实验通过调节基础培养基中NaNO3,FeSO4和NaAc的浓度,设计L9(33)正交表进行试验,正交试验所用因素和水平如表1,设3个重复以减少误差,期望证实营养盐缺乏、盐胁迫及氧化压力对细胞的综合影响.正交实验结果采用方差分析,结果见表2,NaNO3浓度对雨生红球藻虾青素的累积影响显著(FNaNO3>F0.05(2,4)),FeSO4和乙酸钠浓度对虾青素的累积并无显著性影响.但从极差分析结果(未列出)表明,高的Fe2+和高浓度的乙酸钠浓度均有利于雨生红球藻的累积,这同文献报道的Fe2+通过Fenton反应产生羟基自由基,羟基自由基作为一种活性氧,为诱导状态下的细胞累积虾青素提供一种氧化压力,从而Fe2+的加入活化了类胡萝卜素合成的酶系统的结论相吻合.对于高浓度的乙酸钠浓度属于高盐胁迫导致的诱导虾青素累积的环境因素之一.但是由于乙酸钠属于有机碳源,作为培养基容易引起细菌增殖,且对虾青素累积含量的提高并没有显著性影响,故我们认为诱导培养基并不需要添加乙酸钠.最优方案组合为:A3B1C3,即FeSO4浓度0.02g/L,NaNO3浓度0g/L,乙酸钠浓度4g/L的修正BBM培养基适合雨生红球藻细胞内虾个素的累积,适宜温度为30℃,接种pH=8.0,光照强度为5000lx,连续光照.经过缺氮的BBM培养基,在30℃,24h连续光照,光照强度为5000lx的条件下进行3次重复验证实验,结果雨生红球藻细胞内累积的虾青素平均含量达到6.72μg·mL-1执着近正交试验第4中出现的虾个素最高含量(数据无显著性差异).因此认为虾青素诱导阶段和细胞增殖阶段在培养基方面的区别就在于诱导阶段和细胞增殖阶段在培养基方面的区别就在于诱导阶段需要的是缺氮的BBM,只要在配制BBM培养基时不添加NaNO3即可,无须再改变其他成份.3雨生红球藻虾青素累积的培养1)试验表明,24℃、1000～1500lx连续光照,pH控制在8.0左右的生长条件适合雨生红球藻游动细胞增殖与生物量的增加,平均生长速率达到0.252d-1.缺氮培养基对于雨生红球藻细胞累积虾青素最为有利,FeSO4和乙酸钠浓度对虾青素的累积无显著性影响.经过缺氮的BBM培养基,在30℃,24h连续光照,光照强度为5000lx的条件下,雨生红球藻细胞内累积的虾青素含量达6.72μg·mL-1.故采用缺少氮源的BBM培养基即可用于雨生红球藻虾青素的累积.2)由于雨生红球藻生物量的累积和虾青素其次级代谢产物虾青素累积所需的培养条件是不同的.故在生产上应考虑采用两步法,即首先在最适生长条件下培养雨生红球藻的运动细胞,最大限度地获取生物量,接着通过改变培养条件诱导虾青素的大量累积.3)有报道指出营养缺陷不是限制细胞转化的主要因素,还有重要的未明物质发挥着调节雨生红球藻细胞周期的作用.这种物质由雨生红球藻本身释放到胞外,具有诱导细胞转化或阻遏细胞分裂