实时荧光定量pcr方法检测我国近海塔玛亚历山大藻复合种sshp

实时荧光定量pcr方法检测我国近海塔玛亚历山大藻复合种sshp

1目前在国际上的应用有害藻华是一种常见的沿海生态现象，可能会通过各种方式损害人类健康和生态安全（st望角，2002；ziech，2000）。一些已知的三叶草类可以产生麻痹性骨碎片（pst），这是一个重要的有害藻华原因。根据目前已知的30种亚历山大藻，有16种可以产生毒素的植物，其中12种可以产生麻痹性骨碎片（anderson性al.，2012；balech，1995）。水中的亚藻通过双壳类和其他动物饲料吸收后，麻痹性苦贝根积聚在动物体内，导致水中消费者的中毒和严重的人类死亡（picataal.，2011）。在世界范围内，由于中毒性苦毒，中毒事件分布最广泛，对人类安全的影响最大。因此，亚历山大海藻的藻类被引起了密切关注。海水中亚历山大藻细胞的密度通常较低,即便在藻华期间,亚历山大藻也很少在浮游植物群落中占据优势.但亚历山大藻的危害效应非常突出,即使在102～103cells·L-1的低密度下,也有可能产生潜在的危害效应(GEOHAB,2001).而且,亚历山大藻属中的部分有毒藻种和无毒藻种形态特征相似,甚至同一藻种也存在有毒和无毒藻株,仅依靠形态学特征难以鉴别.因此,在亚历山大藻藻华研究中,灵敏度高、特异性强的分子生物学方法近期得到了快速发展,并逐渐应用于亚历山大藻的藻华监测和研究中.其中,实时荧光定量PCR(Real-timequantitativePCR,qPCR)是一种很有前景的方法,已在欧洲、日本及美国近海的亚历山大藻藻华研究中得到应用(Dyhrmanetal.,2006;Galluzzietal.,2004;Hosoi-Tanabeetal.,2004),也被成功用于亚历山大藻孢囊的检测(Erdneretal.,2010;Kamikawaetal.,2007).亚历山大藻广泛分布于我国近海,目前已发现了塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarense)、链状亚历山大藻(A.catenella)、微小亚历山大藻(A.minutum)、相关亚历山大藻(A.affine)等藻种.近年来,有关我国近海亚历山大藻藻华的报道逐渐增多,自2002年以来,长江口及其邻近海域连续多年爆发亚历山大藻藻华,部分海域亚历山大藻细胞密度高达106cells·L-1.同时,贝类中也经常检测到PST毒素,中毒事件多次发生.2008年,因食用染毒杂色蛤,江苏连云港发生了七人中毒、一人死亡的中毒事件(庞中全,2009);2010年,养殖池塘海水中的亚历山大藻引发了毛蚶(Scapharcasubcrenata)中毒事件,造成14人中毒(赣榆县疾控中心,2010);同年,香港发生了食用虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)引起的麻痹性贝毒中毒事件,共有28人出现中毒症状(广东省卫生厅,2010).有毒亚历山大藻的藻华对我国沿海的海水养殖和水产品消费者的身体健康构成了巨大威胁.塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻是我国近海最为常见的麻痹性贝毒产毒藻,这两种亚历山大藻与芬迪湾亚历山大藻(Alexandriumfundyense)的形态特征相似,核糖体RNA基因序列相近,因此,这3种亚历山大藻也被合称为塔玛亚历山大藻复合种(Alexandriumtamarensespeciescomplex)(Lilyetal.,2007).但在塔玛亚历山大藻复合种中,基于核糖体RNA基因序列划分的核糖体型与形态种却不能一一对应.以往研究表明,目前我国近海分离的塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻藻株大多属于塔玛亚历山大藻复合种第四类核糖体型(GroupⅣ),或称亚洲温带核糖体型(Wangetal.,2008;唐祥海等,2006),可以采用相同的分子生物学方法进行检测.目前,针对塔玛亚历山大藻复合种(GroupⅣ)已建立了荧光原位杂交方法(于仁成等,2006),并对海水中的亚历山大藻样品进行了检测.结果表明,该方法具有良好的定性鉴别能力,但在定量分析方面还有所欠缺.近年来,qPCR方法也开始应用于我国的有害藻华研究,目前已针对我国近海多种有害藻华原因种建立了qPCR检测方法(Yuanetal.,2012;石彦红等,2010;Heetal.,2009;何闪英等,2007),并尝试将该方法应用于海水样品中东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi)和中肋骨条藻(Skeletonemacostatum)的检测,取得了良好的效果(Yuanetal.,2012).然而,到目前为止,对我国近海亚历山大藻复合种的qPCR检测方法尚未见研究报道.因此,本研究针对我国近海的塔玛亚历山大藻复合种(GroupⅣ),尝试将实时荧光定量PCR方法用于亚历山大藻的快速识别和计数,并对方法的特异性、灵敏度,以及影响qPCR结果准确性的因素进行分析和研究.2材料和方法表面活性剂2.1保种与微生物培养实验所用藻株及其分离地如表1所示,实验中将分离自东海的链状亚历山大藻(ACDH藻株)作为目标藻构建标准曲线,以其它藻株进行对比研究.所有实验藻株均在中国科学院海洋研究所海洋生态与环境科学重点实验室内保种培养,培养液采用f/2营养盐配方.培养用海水系取自青岛汇泉湾附近的自然海水,经过海洋所水族楼的海水处理系统过滤和消毒,pH值为7.9±0.1,盐度为30±1.进入实验室后首先以0.45μm混合纤维滤膜过滤,并煮沸灭菌,室温冷却后添加营养盐备用.所有保种用具均经高压蒸气灭菌20min.实验藻类培养温度为(21.0±0.5)℃,光照约为4000lx,光暗比(L∶D)为14h∶10h.2.2藻核糖体大亚基rna基因序列的扩增和测序本研究中所用的qPCR方法参考Kamikawa等(2007)建立的TaqmanqPCR方法.该方法采用一对引物对提取DNA样品进行靶序列扩增,并以一条荧光标记的特异性探针对扩增产物进行标记,以便定量分析.引物和探针系针对日本近海链状亚历山大藻核糖体大亚基RNA基因的D1～D2区设计.2.2.1引物及探针的设计与合成根据本实验室以往研究中得到的中国近海塔玛亚历山大藻复合种28SrDNA的序列信息,结合GenBank中已知亚历山大藻的LSUrDNA的序列信息,参考Kamikawa等(2007)引物和探针设计的靶区,以Primer5软件设计探针,并手工对比优化,设计了一对引物与一条特异性探针,分别命名为catF:5′-CCTCAGTGAGATTGTAGTGC-3′和catR:5′-GTGCAAAGGTAATCAAATGTCC-3′,TaqMancat:5′-FAM-ATGGGTTTTGGCTGCAAGTGCA-TAMRA-3′,目标片段长度为106bp.引物及探针由大连宝生物公司合成.2.2.2l-1tris-hclDNA的提取参考ShokoHosoi-Tanabe的方法(Hosoi-Tanabeetal.,2005).收集的藻细胞采用400μLTE缓冲液(10mmol·L-1Tris-HCl,pH=7.5;1mmol·L-1EDTA,pH=8.0)重悬,100℃煮沸5min.加入400μL苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)混合液,室温振荡后,经离心将上清液转至干净的Eppendorf管中.然后加入15μL3mol·L-1醋酸钠(pH=5.2)与400μL无水乙醇(-20℃),于4℃静置20min以上.离心后以70%乙醇清洗DNA两次,干燥并溶于20μLTE缓冲液中.2.2.3pcr扩增条件采用EppendorfMastercyclereprealplex实时荧光定量PCR仪进行qPCR反应,反应体系为:PremixExTaqTM12.5μL,双蒸水8.5μL,正反向引物(10μmol·L-1)各1μL,Taqman探针(5μmol·L-1)2μL(TaKaRaBioInc.),DNA模板2μL.PCR程序:95℃预变性30s;95℃变性5s,60℃退火30s,共40个循环.2.3方法验证和样本分析2.3.1qpcr反应分别选择:①链状亚历山大藻(ACDH藻株),②链状亚历山大藻(ACDH藻株)+微小亚历山大藻(AM藻株)+相关亚历山大藻(AC-1藻株)+中肋骨条藻(SC-1藻株)的混合藻样,③添加ACDH藻株的天然海水样品,④AM藻株,⑤AC-1藻株,以及⑥AM藻株+AC-1藻株+SC-1藻株的混合藻样等,进行qPCR反应,将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,根据电泳图和qPCR反应图,分析引物的特异性.2.3.2qpcr分析取9000个ACDH藻细胞,按照2.2.2节方法提取DNA,并对提取的DNA样品进行逐级2倍梯度稀释,以稀释后样品进行qPCR分析,每一样品重复3次,分析每一样品Cq值(QuantificationCycle)与DNA模板量的线性关系.2.3.3qpcr检测藻细胞的表达以分离自东海的链状亚历山大藻ACDH藻株作为目标藻,以同一培养阶段的藻细胞构建分析的标准曲线,分别取5、10、50、100、500、1000、5000、10000个链状亚历山大藻细胞,其中,5、10个细胞组通过毛细管挑取单细胞获得,50、100、500、1000、5000、10000个细胞组通过显微镜计数后并逐级稀释获得,所有样品均取1mL藻液,离心后提取DNA,每一浓度做3个平行.将qPCR反应所得Cq值与细胞数的对数值通过线性回归拟合作为标准曲线,以最低细胞密度的响应情况来代表其检出限.2.3.4藻细胞dna提取选取5株分离自中国沿海不同海域的塔玛亚历山大藻或链状亚历山大藻(表1),取处于对数生长期的藻细胞,用灭菌海水稀释至3000cells·mL-1.每一样品重复测定3次,每次取1mL稀释藻液离心收集藻细胞,提取DNA,并以所建立的qPCR方法进行定量分析.2.3.5藻细胞qpcr检测分别培养链状亚历山大藻ACDH藻株和塔玛亚历山大藻ATCI03藻株,培养条件如2.1节所述,初始接种密度均为500cells·mL-1.自接种日起,每隔3d采集一次样品,在显微镜下计数细胞密度.同时,取样进行qPCR分析,每次采集3个样品,每一样品收集3000个藻细胞,置于-20℃冻存,直至两株藻进入衰亡期.将冻存的细胞提取DNA,并进行qPCR检测.2.3.6藻细胞qpcr检测自青岛汇泉湾取自然海水样品,经200μm筛绢过滤后,显微镜下观察确认无亚历山大藻细胞存在.取一定数量室内培养的链状亚历山大藻ACDH藻株添加到自然海水样品中,作为自然海水模拟样品,用所建立的qPCR方法对亚历山大藻细胞数进行检测.实验共设置2个浓度,分别含有500个和3000个亚历山大藻细胞,每一浓度设3个平行.将样品以碘液固定后分级沉降至10mL,离心收集藻细胞,提取DNA,进行qPCR反应.2.4火炬树不同生长阶段样品qpcr检测结果比较分析采用SPSS软件,通过对样品的描述性统计分析、方差齐性分析及多重比较,分析塔玛亚历山大藻复合种不同藻株和不同生长阶段样品的qPCR检测结果之间差异的显著性.3结果和分析结果和分析3.1pcr扩增效果及对目标序列的敏感性检测以qPCR方法中设计的引物扩增2.3.1节中6个藻类样品的DNA,结果发现,仅在含有目标藻ACDH藻株的3个样品中扩增到了大小约100bp的片段,其他样品中均未检测到扩增的PCR产物(图1).结果表明,该引物能够对塔玛亚历山大藻复合种的目标序列(LSUrRNA基因)进行特异性扩增.3.2qpcr检测dna模板稀释个数的线性响应将从ACDH藻株中提取的DNA模板逐级稀释后,经qPCR检测,其结果与DNA模板稀释倍数之间的关系如图2所示.结果表明,qPCR的Cq值与DNA模板量(以稀释倍数表示)之间具有良好的线性响应关系,R2值为0.999,可见该qPCR方法对添加的目标藻DNA模板量具有良好的线性响应.3.3标准工作曲线按2.2节所述方法提取亚历山大藻模板DNA,以细胞数为横坐标,以实时荧光定量PCR方法分析得到的Cq值为纵坐标,绘制标准工作曲线,结果如图3所示.受到样品DNA提取效率及细胞之间的差异等因素的影响,方法的拟合度略低,但两者之间仍具有良好的线性关系,R2值可达0.978.3.4藻细胞增殖检测对实验室培养的5株塔玛亚历山大藻复合种(ATCI02、ATCI03、AT5-3、ATHK为分离自南海的塔玛亚历山大藻藻株,ATCI02为分离自东海的链状亚历山大藻藻株),各取相同数量的对数生长期藻细胞,应用所建立的qPCR方法进行定量检测,结果如图4所示,分析结果表明,在5株塔玛亚历山大藻中,有4株检测结果基本一致,而分离自南海海域的ATCI03藻Cq值明显偏低.Duncan检验结果也显示,ATCI03组的Cq值与其它4组存在显著差异(p<0.05),5株藻之间的组间差异主要来自ATCI03,其它4株藻的扩增结果没有显著差异.3.5不同生长阶段藻体cq值的差异对链状亚历山大藻ACDH藻株和塔玛亚历山大藻ATCI03藻株不同生长阶段的藻细胞进行检测,结果如图5所示.可以看出,处于不同生长阶段的亚历山大藻得到的检测结果存在明显差异,对于细胞数相同的样品,在对数生长初期采集样品的Cq值明显低于对数生长中期及稳定期的样品.相同藻细胞密度下,ATCI03藻株样品的Cq值低于ACDH藻株,这两个藻株间的差异并不能用生长阶段的差别来解释.3.6自然海水淡化工程回收率的现状与分析应用qPCR检测方法,对制备的自然海水模拟样品进行了分析,所得到的检测结果如表2所示.可以看出,根据qPCR所得到的检测结果低于真实细胞浓度,两组链状亚历山大藻细胞的检测回收率在60%～70%之间.对自然海水样品沉降浓缩、离心浓缩及DNA提取过程的逐步分析表明,回收率偏低的原因主要来自沉降浓缩过程中目标藻细胞的丢失,这是造成检测结果偏低的主要原因之一.4qpcr方法的灵敏度在有害藻华研究中,由于有毒藻种和无毒藻种的形态学特征相似,而且海水中有毒藻类的细胞密度通常很低,因此,基于形态学特征的传统显微观察等方法往往难以满足有毒藻类的研究需求.与传统方法相比,分子生物学方法快速、灵敏、特异性高,特别适应于对低密度的有毒藻类进行检测.许多分子生物方法,如基因序列测定、荧光原位杂交、三明治杂交、实时定量PCR等开始逐渐应用于有害藻华研究(Zhenetal.,2009;梁斌等,2009;于仁成等,2006;张宝玉等,2005).同时,基于分子生物学技术的有毒有害藻类监测仪器和设备也开始逐渐投入使用,如美国研发的环境样品处理器(EnvironmentalSampleProcessor,ESP),是一种全自动赤潮藻类与藻毒素监测设备,可实现自主化采样、检测、数据分析和信息传递(Scholinetal.,2006).目前该设备已开始在美国缅因湾等海域布设,用于亚历山大藻的现场调查及毒性检测工作.同时,欧盟资助的基于基因芯片的有害藻类检测技术(ALGADEC)也取得了重要进展,已经开发出一种可用于有害藻华监测的半自动化检测设备(Diercks-Hornetal.,2011).与其他分子生物学方法相比,qPCR方法具有良好的特异性和灵敏度(Yuanetal.,2012;Dyhrmanetal.,2006;Galluzzietal.,2004;Hosoi-Tanabeetal.,2004).本研究中建立的qPCR方法,可以将塔玛亚历山大藻复合种(GroupⅣ)与其他亚历山大藻藻种区分开来,具有良好的特异性.同时,根据本文的检测结果,低至5个藻细胞即可被检出.Galluzzi等(2004)根据其建立的标准工作曲线计算,最低可检测到0.2个细胞,完全可满足实际检测工作的需求.在以往研究中发现,与其它微藻检测方法相比,qPCR方法得到的检测结果与藻细胞密度显著相关,但其结果的准确性相对较低.qPCR方法的准确性受到许多因素的影响,其中,用于构建标准工作曲线的目标藻与实际样品中的目标藻靶基因拷贝数差异是一个重要原因.目前,有害藻华研究中常选用核糖体RNA基因作为qPCR方法的靶基因,其拷贝数在不同藻种甚至同一藻种的不同藻株之间会存在显著差别.Prokopowich等(2003)分析了细胞DNA含量在0.12～54.7pg·cell-1之间的一系列微藻,发现不同微藻核糖体RNA基因拷贝数存在很大差异.同一藻种的不同地理株之间也存在核糖体拷贝数的差异.Galluzzi等(2004)对分离自地中海的A.catenella和A.taylori的核糖体RNA基因拷贝数研究发现,不同藻株的核糖体RNA基因拷贝数有明显差别.本文研究也发现,分离自我国沿海不同海域的塔玛亚历山大藻复合种各藻株之间也存在核糖体拷贝数的差异,这会影响到qPCR检测结果的准确性.对此,建议在应用qPCR方法时,应尽可能针对目标藻的当地藻株建立标准工作曲线,以消除不同地理株间核糖体RNA基因拷贝数差异造成的系统误差.此外,Dyhrman等(2006)曾提出采用不同藻株的混合样品作为标准品建立标准曲线,可在一定程度上降低不同藻株间核糖体RNA基因拷贝数差异所带来的误差.除不同地理株间靶基因拷贝数的差异之外,不同生长状态和生活史阶段微藻细胞内靶基因拷贝数的变化也会对qPCR检测结果造成影响.受细胞周期DNA合成的影响,处于不同生长期的微藻靶基因拷贝数会有显著变动.