蓝藻水华暴发期间产毒微囊藻和总微囊藻丰度空间分布研究

蓝藻水华暴发期间产毒微囊藻和总微囊藻丰度空间分布研究

富营养化湖泊中的藻类蓝藻的频繁发生及其造成的灾害是世界上最常见的水环境问题之一。蓝藻水华产生的微囊藻素及其衍生物直接导致水生动植物的死亡，并对人类健康和生活提出严重危害。微藻属于蓝藻水华中最常见的优势种群之一。根据许多研究，湖泊微藻水华群是由微藻和非微藻组成的“混合群落”。微藻微囊藻群落的丰度动态变化及其总微囊藻群落的比例受多种环境的影响。在不同的湖泊生态系统中，微囊藻微囊藻的时空变化特征是空间变化的特征[3.5]。微囊藻微囊的丰度直接决定了微囊藻水华的毒性，微囊藻的最佳评价浓度在一些湖泊中是评价微囊藻素浓度变化的最佳指标。因此，对微囊藻微囊素群落的定量化研究具有重要意义。一般是利用显微观察法对水体中微囊藻细胞密度进行研究,产毒微囊藻和非产毒微囊藻细胞形态相似,利用显微观察法无法将产毒株和非产毒微囊藻细胞区分开来.产毒微囊藻细胞基因组中含有微囊藻毒素合成基因家族(Microcystinsynthetasegenecluster,mcy),对微囊藻毒素产生进行调控.该基因家族成员组织结构和序列特征已经非常清楚,为利用PCR扩增检测产毒微囊藻奠定了基础[7~9].特异性扩增微囊藻毒素合成基因家族普通PCR检测可以对蓝藻水华是否产毒做出判断,但是无法准确获得产毒微囊藻细胞密度.荧光定量PCR利用特异性引物,能够对样品中的目标生物进行定量化研究,具有灵敏度高、重复性好、能够同时处理大批量样品等优势,近年来在蓝藻水华的研究中已经广泛应用[10~12].1材料和方法1.1水质特征和采样点根据太湖富营养化水平和蓝藻分布情况,在太湖设置7个采样点.分别位于梅梁湾(N2)、竺山湾(N5)、贡湖湾(N4)、湖心(S4)、西太湖(W4)、南太湖(S2)和梅梁湾口(S5).根据巢湖富营养化水平,在巢湖也设置7个采样点,从西巢湖到东巢湖分别编号为1、2、3、4、5、6和7,其中1、2和3号采样点位于西巢湖,4号采样点位于湖心,5、6和7号采样点位于东巢湖.采样点的分布如图1所示.太湖和巢湖均属于长江水系.太湖地处北纬30°56′~31°34′和东经119°53′~120°34′之间,面积2338.11km2,平均水深2m左右,是我国第三大淡水湖泊.巢湖位于安徽省中部,处于长江、淮河两河流之间,湖体位于117°16′~117°51′E,30°25′~31°43′N之间,面积约为780km2,是我国第五大淡水湖泊.太湖和巢湖均是典型的浅水富营养湖泊,自从20世纪80年代以来,夏季蓝藻(主要是微囊藻Microsystisspp.)水华频繁发生,严重影响了经济和社会的发展.微囊藻是太湖和巢湖夏季蓝藻水华的优势种群,其生物量占藻类生物量的90%以上[15~16].到目前为止,尚未见有关蓝藻水华暴发期间太湖和巢湖产毒微囊藻种群丰度的报道.本研究利用荧光定量PCR技术,从大的空间尺度上分析太湖和巢湖蓝藻水华暴发期间产毒微囊藻和非产毒微囊藻种群丰度的分布特征,以期为蓝藻水华生态风险评估提供资料.2010年夏季(7月份)采集水样,采样期间太湖和巢湖都正暴发大规模的蓝藻水华.用GPS定位系统对采样点精确定位.用长度为2.5mPVC管采集整水柱,混合均匀,每个采样点采集3个平行样.所有水样均在4h内带回实验室做进一步处理.同时利用多功能水质参数仪YSI6600(YellowSpringInstruments,USA)测定采样点水质参数,主要包括水温、溶解氧、电导率、pH和混浊度等.1.2溶解氮磷的测定GF/F玻璃纤维滤膜过滤50mL水样,用Skalar(SkalarSanplusanalyzer荷兰)自动漂流分析装仪测定水体中溶解性氮磷,主要包括氨态氮、硝态氮、可溶性正磷酸盐.水体中总氮、总磷(均未过滤)参照标准方法测定.1.3叶绿素a的提取GF/C滤膜过滤100mL水样(根据生物量大小调整水样体积),用90%丙酮提取滤膜叶绿素a,充分研磨后置于-4℃,黑暗条件下静置12h,离心,取上清液,用90%的丙酮定容,用荧光分光光度计(RF-5301)测定,激发波长为350nm,发射波长670nm.1.4藻类基因组的提取GF/C滤膜过滤100mL水样(根据微囊藻生物量大小调整水样体积),滤膜置于-20℃保存.滤膜上藻类基因组提取按照文献的方法进行.最后将基因组DNA溶于100µLTE溶液中,-20℃保存备用.1.5荧光定量pcr检测利用室内纯培养产毒微囊藻Microcystisaeruginosa7806构建定量PCR标准曲线,该藻株由中国科学院典型培养物种淡水藻种库(FACHB)提供.培养基为BG-11,培养温度25℃,光照强度为40μmolm-2s-1,光照周期为12h/12h.将处于对数生长期的藻细胞过滤到GF/C滤膜上,按照文献的方法提取基因DNA,最后用超纯水溶DNA.BioPhotometerPlus(Effendorf)测定基因组DNA的浓度和纯度(ABS260nm/ABS280nm).根据文献方法计算基因组拷贝数,将标准基因组DNA稀释成一定梯度(共6个梯度),每个梯度3个平行.用微囊藻16SrDNA基因和产毒微囊藻mcyD基因的特异性引物进行定量PCR反应(表1).qPCR反应体系25µL,其中含有12.5µL2×SYBRpremixExTaqTM(TaKaRa),其中微囊藻16SrDNA引物浓度为4pmol,mcyD引物2.5pmol,1µL模板,用超纯水将定量PCR体系补足25µL.荧光定量PCR反应过程如下:95℃2min,按95℃20s,55℃30s,72℃20s反应,共45个循环,反应结束后进行溶解曲线(Meltingcurve)分析.整个过程在REALPLEX4荧光实时定量PCR仪(Effendorf公司)上进行.反应结束后将将定量PCR数据导入Excel表格进行分析,绘出标准曲线.2结果与分析2.1srdna和mcyd基因利用微囊藻产毒株MicrocystisaeruginosaPCC7806基因组DNA作为模板建立16SrDNA基因和mcyD基因定量PCR标准曲线,从图2和图3可以看出,循环阈值(Ct)和基因组拷贝数的对数值呈显著线性关系.定量PCR反应中,基因组拷贝数动态范围为1.57×101~1.57×107copies.16SrDNA序列定量PCR标准曲线方程为Y=-3.54X+43.01(R2=0.998),扩增效率e=0.92.mcyD基因定量PCR标准曲线方程为Y=-3.36X+42.81(R2=0.995),扩增效率e=0.98.溶解曲线结果显示,16SrDNA和mcyDPCR扩增产物解链的峰值温度分别为分别为88.92℃(变异系数CV=0.12%)和84.47℃(变异系数CV=0.11%).2.2太湖水生理化参数、a浓度和物种丰度2.2.1营养盐浓度结果在采样期间,水体平均温度为26.6℃,水体呈偏碱性,溶解氧浓度为7.52~8.53mgL-1,混浊度为25.9~85.5.营养盐浓度如表1所示,TN浓度为1.797~2.826mgL-1,平均浓度为2.529mgL-1.TP浓度为0.071~0.196mgL-1,平均浓度为0.115mgL-1.其中富营养化严重的梅梁湾(N2)和竺三湾(N5)营养盐浓度相对较高,湖心(S4)和贡湖湾(N4)营养盐浓度较低.2.2.2梅梁湾和全面6个月的叶绿素a浓度如图4所示,太湖蓝藻水华期间,叶绿素a浓度较高,并且不同湖区叶绿素a浓度差异显著:富营养化水平较高的梅梁湾和竺三湾叶绿素a浓度较高,分别达到156.14µgL-1±10.11µgL-1和140.82µgL-1±4.85µgL-1,湖心(S4)和西太湖(W4)叶绿素a浓度相对较低,分别为23.80µgL-1±3.17µgL-1和13.91µgL-1±1.97µgL-1.2.2.3微囊藻16srdna基因型丰度和产毒微囊藻mcyd基因型丰度的比较荧光定量PCR结果(图5)显示,太湖微囊藻种群丰度及其基因型组成具有显著的空间差异性:梅梁湾(N2)微囊藻16SrDNA基因型丰度和产毒微囊藻mcyD基因型丰度最高,湖心(S4)16SrDNA和mcyD基因型丰度最低.梅梁湾基因型丰度高出湖心1~2个数量级.产毒微囊藻mcyD基因型丰度占总微囊藻16SrDNA基因型丰度比值为为20.5%~38.1%,平均比值为28.5%.2.3巢湖水生理化参数、a浓度和物种丰度2.3.1营养盐浓度采样期间,巢湖平均水温为29.8℃,水体呈碱性,6号采样点pH最高.溶解氧浓度为7.45~9.31mgL-1.营养盐浓度如表3所示,总氮浓度为1.612~3.955mgL-1,平均值为2.107mgL-1,总磷浓度为0.044~0.201mgL-1,平均值为0.097mgL-1,西巢湖(1、2和3号采样点)营养盐水平高于东巢湖(5、6和7号采样点).2.3.2不同采样点叶绿素a浓度a如图6所示,巢湖蓝藻水华期间,叶绿素a浓度较高,并且不同湖区叶绿素a浓度差异显著:从西巢湖向东巢湖叶绿素a浓度呈下降趋势,其中1号采样点叶绿素a浓度最高,为206.90µgL-1±10.44µgL-1,5号采样点叶绿素a浓度最低,为42.65µgL-1±4.38µgL-1.2.3.3品种和基因型丰度如图7所示,巢湖不同湖区微囊藻16SrDNA基因型和产毒微囊藻mcyD基因型丰度分布.总的来说,巢湖西半湖区(1,2和3号采样点)16SrDNA和mcyD基因型丰度高于巢湖东湖区(5、6和7号采样点).产毒微囊藻mcyD基因型丰度占微囊藻16SrDNA基因型丰度比值波动较大,该比值在湖心的4号采样点最低,为8.4%,而7号采样点该比值最高,为96.6%,所有采样点该比值的平均值为66.1%.3不同产毒微囊藻种群丰度的定量化研究太湖和巢湖均为我国长江中下游重要的大型浅水湖泊.随着人类社会的快速发展,湖泊污染日益严重,大量的营养物质(氮、磷)输入湖体,湖泊快速向富营养水平发展,导致夏季蓝藻水华频繁发生.根据孔繁翔等提出的长江中下游大型浅水湖泊蓝藻水华形成的四阶段理论,蓝藻水华形成是蓝藻生物量逐渐积累的过程,在适宜的温度、光照、营养盐和水文气象条件下形成的.夏季蓝藻水华爆发期间,太湖和巢湖水体中叶绿素a(Chl-a)浓度均超过10µgL-1,不同湖区分布间呈现出空间差异性:在太湖,污染严重的梅梁湾太湖梅梁湾(N2)和竺山湾(N5)叶绿素a浓度较高,分别为156.14µgL-1±5.11µgL-1和140.82µgL-1±2.66µgL-1,西太湖(W4)和湖心(S4)叶绿素a浓度较低,分别为13.97µgL-1±1.91µgL-1和23.80µgL-1±2.17µgL-1;巢湖叶绿素a浓度从西湖区到东湖区呈下降趋势,与巢湖富营养化水西高东低的变化趋势基本一致.这说明湖泊的富营养化水平与水华蓝藻的生物量有一定的相关性,富营养化严重的湖区水华蓝藻生物量高于低营养化水平的湖区.这与Rinta-Kanto等的研究结果是一致的.Rinta-Kanto等通过对美国伊犁湖夏季水华蓝藻连续3年的研究发现,富营养化水平严重的西湖区叶绿素a浓度和蓝藻16SrDNA基因型丰度高于东湖区.同时,水华蓝藻的空间分布会受到风场直接或间接作用的影响[22~23],但是蓝藻迁移和蓝藻原位生长对特定湖区蓝藻的贡献量的大小还需进一步研究.近年来,荧光定量PCR在夏季蓝藻水华研究中应用广泛.该技术能够同时处理大批量样品,对产毒微囊藻种群进行定量化研究,可以快速对蓝藻水华毒性做出判断,预测蓝藻水华带来的生态风险.本研究利用微囊藻毒素合成基因mcyD和16SrDNA构建定量PCR标准曲线,对太湖和巢湖产毒微囊藻种群和总微囊藻种群丰度进行定量化研究.从研究结果可以看出,太湖和巢湖不同湖区产毒微囊藻种群和总微囊藻种群丰度的分布具有空间差异性.对太湖而言,富营养化严重的梅梁湾和竺山湾产毒微囊藻和总微囊藻种群丰度均较高,而湖心(S4)产毒微囊藻和总微囊藻种群丰度较低;对巢湖而言,产毒微囊藻和总微囊藻种群丰度从西湖区到东湖区呈下降趋势.同时发现,太湖和巢湖产毒微囊藻占总微囊藻种群丰度的比例在不同湖区有显著差异:太湖湖心(S4)产毒微囊藻占总微囊藻种群比值最小,为20.5%,竺山湾最高,为38.1%,所有湖区的平均值为28.5%;巢湖湖心(4号采样点)产毒微囊藻占总微囊藻总微囊藻种群的比例最低,为8.4%,7号采样点最高,为96.6%,巢湖所有采样点该比值的平均值为66.1%.可以看出,富营养化水平高的湖区,产毒微囊藻和总微囊藻种群丰度也较高,说明营养盐浓度升高有利于产毒微囊藻和非产毒微囊藻生长.Rinta-Kanto通过对伊犁湖研究后发现产毒微囊藻和非产毒微囊藻种群丰度随TP浓度升高而增加,并且种群丰度和总磷浓度具有显著的正相关性.这和Vézie等人室内的研究结果是一致的.本文的研究结果同时解释了Shen等的研究结果,Shen等发现太湖蓝藻水华期间富营养化水平高的湖区水华蓝藻微囊藻毒素浓度也较高,与该湖区产毒微囊藻种群丰度高低有直接的关系.同时发现,产毒微囊藻占总微囊藻种群的比例在太湖和巢湖有显著的差异性:在太湖,所有湖区产毒微囊藻占总微囊藻种群丰度的比例低于50%,并且和采样点的富营养化水平具有一致性,富营养化水平高的湖区产毒微囊藻占总微囊藻种群的比例也较高.而巢湖的产毒微囊藻占总微囊藻种群的比例波动较大:巢湖湖心(4号采样点)该比值最低,其它采样点该比值均较高,其中7号采样点该比值为96.6%.已有的文献报道,不同湖泊产毒微囊藻占总微囊藻种群丰度的比值波动范围较大,该比值可以从0到100%.多种环境因子都能影响产毒微囊藻占总微囊藻种群的比例.Yoshida等研究了湖泊Mikata中产毒微囊藻和非产毒微囊藻种群动态随时间变化规律,发现硝态氮浓度与