植物DNA的提取与测定

植物DNA的提取与测定一、 目的随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA的原理并掌握CTAB提取DNA的方法，进一步了解DNA的性质。二、 原理细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。DNP与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl溶液为例：RNP在0.14mol/LNaCl中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1%。当NaCl浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP的溶解则随之不断增加。当NaCl浓度大于1mol/L时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2倍，因此通常可用1.4mol/LNaCl提取DNA。为了得到纯的DNA制品，可用适量的RNase处理提取液，以降解DNA中搀杂的RNA。关于植物总DNA的提取主要有两种方法：CTAB法：CTAB（十六烷基三甲基漠化铵， hexadecyltrimethylammoniumbromide,简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。SDS法：利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodiumdodecylsulfate,简称SDS）使DNA与蛋白质分离，在高温（55〜65°C）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA的分子量为克隆片段长度的4倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase对DNA的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。几乎所有的DNase都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）。为实现（2）需要在DNA处于溶解状态时，尽量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行DNA溶液转移时用大口（或剪口）吸管。提取的DNA是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点〃（meltingtemperature,Tm）测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法鉴定。三、实验材料、主要仪器和试剂实验材料新鲜菠菜幼嫩组织、花椰菜花冠或小麦黄化苗等主要仪器高速冷冻离心机751型分光光度计恒温水浴液氮或冰浴设备磨口锥形瓶核酸电泳设备试剂(CTAB法)CTAB提取缓冲液：100mmol/LTris-HCl(pH8.0),20mmol/LEDTA-Na2,1.4mol/LNaCl(如表1),2%CTAB,使用前加入0.1%(V/V)的8-巯基乙醇。表1CTAB提取缓冲液配制用HCl调pH值。TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl,1mMEDTA(pH8.0)。DNase-freeRNaseA:溶解RNaseA于TE缓冲液中，浓度为10mg/mL,煮沸10〜30min,除去DNase活性，一20°C贮存(DNase为DNA酶,Rnase为RNA酶)。氯仿-异戊醇混合液(24:1,V/V):240mL氯仿(A.R.)加10mL异戊醇(A.R.)混匀。3mol/L乙酸钠(NaAc,pH6.8):称取NaAc-3H2O81.62g,用蒸馏水溶解，配制成200mL,用HAc调pH至6.5。95%乙醇TE缓冲液，Tris-HCl(pH8.0)液，NaAc溶液均需要高压灭菌。四、操作步骤称取2〜5g新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料，用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面，用滤纸吸干水分备用。叶片称重后剪成1cm长，置研钵中，经液氮冷冻后研磨成粉末。待液氮蒸发完后，加入15mL预热(60〜65C)的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65C水浴保温，0.5~1h，不时地轻轻摇动混匀。加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。将锥形瓶中的液体倒入离心管中，在室温下4000r/min离心5min,静置，离心管中出现3层，小心地吸取含有核酸的上层清液于量筒中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入1〜2倍体积预冷的95%乙醇，边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀(主要为DNA)迅速缠绕在玻棒上。小心取下这些纤维状沉淀，加1〜2mL70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA粗制品。上述DNA粗制品含有一定量的RNA和其它杂质。若要制取较纯的DNA，可将粗制品溶于TE缓冲液中，加入10mg/mL的RNase溶液，使其终浓度达50^g/mL，混合物于37°C水浴中保温30min除去RNA。重复步骤2〜5的操作，可制得较纯的DNA制品。将DNA制品溶于250皿的TE缓冲液中，完全溶解DNA样品。加入1/10倍体积的3mol/LNaAc（pH6.8）和2倍体积的95%乙醇，沉淀DNA，重复步骤5。最后，将DNA溶于250皿的TE缓冲液中。在751型分光光度计上测定该溶液在260nm紫外光波长下的光密度值。代入下式计算DNA的含量。四、结果计算式中OD260nm为260nm处的光密度；L为比色杯光径（cm）；0.020为1^g/mLDNA钠盐的光密度。DNA的紫外吸收高峰为260nm，吸收低峰为230nm，而蛋白质的紫外吸收高峰为280nm。上述DNA溶液适当稀释后，在751分光光度计上测定其OD260nm、OD*nm和0。^“|^。如O^.nnm/OD*nm22OD肘nm/O^nnm>1.8，表示RNA230 280 260 230 260 280已经除净，蛋白含量不超过0.3%。五、 附注如果植物样品不经液氮处理，提取液中的CTAB浓度需要提高到4%（W/V）。在许多情况下，使用0.1%（V/V）巯基乙醇，并不能完全抑制叶片中的氧化作用，但是，这种氧化作用不会影响限制性内切酶的活性。如果使用的巯基乙醇浓度高于0.1%（V/V），则会大大降低DNA的得率。六、 思考题制备的DNA在什么溶液中较稳定？为了保证植物DNA的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？参考答案制备的DNA在：（1）含有螯和剂如EDTA中较稳定，因为EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase；（2）在pH5〜9之间较稳定，否则过酸过碱会破坏DNA的结构；（3）有一定离子强度（强度越高,DNA越稳定）的溶液中较稳定。（TE满足以上要求，但如需对所得DNA进行酶切,E