核酸理化性质讲义

核算理化性质-讲义目录一般物理性质；核酸的紫外吸收；变性；复性；杂交；教学目的：了解核酸的一般物理性质及DNA序列的测定方法，掌握核酸的紫外吸收特性、变性和复性及核酸的分离、提纯和定量测定。教学重点：核酸的紫外吸收及变性和复性；教学难点：核酸的变性和复性一般物理性质1.1形态图DNA——白色纤维状固体图 RNA——白色粉末状固体1.2溶解性微溶于水；不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂；用乙醇可以沉淀核酸。RNA核蛋白体（RNP）易溶于0.14mol/LNaCl溶液；DNP可溶于1~2mol/L的NaCl溶液；RNA在碱性溶液中不稳定；DNA在碱性溶液中稳定。显色反应：利用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定DNA与RNA。核糖与地衣酚（3,5-二羟甲苯）试剂反应呈鲜绿色。脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应。1.3粘度图DNA溶液粘度极高（因其分子直径小而长度大）图 RNA溶液粘度要小得多 ★核酸变性或降解后，粘度降低1.4两性解离图概念：核酸为两性电解质，因核苷酸含有磷酸基与碱基，磷酸基和碱基可以解离，在不同pH条件下解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离子，表现为两性离子状态，通常表现为酸性。效果：由于磷酸基团的酸性很强，所以pI（等电点）较低，整个分子相当于多元酸。应用：利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的pH来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。紫外吸收性质2.1机理：嘌吟和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。2.2性质1：在260nm处有最大吸收峰。对于纯的DNA或RNA，可以通过测得A260来推测其核酸含量。A260/A280值可以反映核酸的纯度。性质2：纯的DNA：A260/A280=1.8 纯的RNA：A260/A280=2.02.3.定义：增色效应（hyperchromiceffect）是变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。原因：DNA分子对紫外光的吸收峰在260nm。DNA分子中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础，但双螺旋结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。变性DNA的双链解开，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故产生增色效应。

差异：不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性后，其260nm的光密度值可增加40%以上，其它不同来源的DNA溶液的增值范围多在20~30%之间。影响：变性后DNA在260nm下的紫外吸收光密度的观测值通常较变性前有明显增加。核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（减色效应）。2.4测定核酸和核苷酸的紫外吸收的意义：★测定核酸在细胞和组织中的分布★测定核酸或嘌吟、嘧啶衍生物或核酸在纯溶液中的浓度前提是知道嘌吟、嘧啶衍生物的摩尔吸光系数K（在一定pH下是常数）A（吸收值）=K（吸光系数）b（溶液厚度）c（溶液浓度）碱基的光吸收值受pH影响，所以测定时要注意一定的pH条件。核算的变性3.1.变性denaturation的概念核酸在某些物理或化学因素的作用下，双螺旋结构被破坏，空间结构发生改变，从而引起理化性质的改变（A260值升高、粘度下降、沉降系数加快、……）及生物活性的降低或丧失。★根据变性因素区分为碱变性、热变性等。如DNA的碱变性、DNA的热变性，其中以DNA的热变性更具典型意义。3.2引起变性的因素物理因素：热（热变性）；紫外、辐射等；化学因素：过酸（酸变性）；过碱（碱变性）；有机溶剂；尿素 原因：使氢键断裂，破坏碱基堆集力，从而引起核酸二级结构的破坏。3.3热变性曲线（熔解曲线）DNA的热变性是个突变过程，类似结晶的熔解。在DNA发生热变性的过程中，A260随温度的变化曲线。——解曲线不同DNA的熔解曲线不同，但很类似。都是——S形曲线2.4Tm值：将紫外吸收的增加量达到最大增量一半时的温度称熔解温度 （meltingtemperature,Tm）。★影响Tm的因素（1） G-C比：G-C的相对含量，值高Tm高，已知Tm,依据经验公式求G-C的含量或Tm值。（G+C）%=（Tm—69.3）X2.44（2） 均一性：质DNA（polyA-T）或（polyG-C）熔链温度发生在一个较小的范围内，异质DNA熔链温度发生在一个较宽的范围内。：（3） 溶液离子强度：（4）溶液的pH：（5）变性剂：核酸的复性4.1复性：变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程。将热变性的DNA骤然降温，不能复性形成无规则线团，如缓慢降温，可以复性，叫退火。4.2影响复性速度的因素：单链片段的浓度，浓度越高，复性越快；单链片段的大小，片段越大,扩散慢，错配频率高，复性越慢；片段内重复序列的多少,片段内重复序列的多，复性快；溶液一定的离子强度，能消除磷酸基负电荷造成的斥力，可加快复性速度。4.3复性过程用二级反应动力学公式处理：dCCo1+Cot-Co1+Cot-kdt0Cot曲线：在核酸复性研究过程中，确定一定的温度、离子强度、核酸片段大小等条件下，以C/Co对Cot作图，可以得到Cot曲线。在一定条件下复性的速度可用Cot班来衡量，Co为完全变性时的初始浓度，以核苷酸的摩尔浓度表示，t为时间（s），Cot1/2表示复性一半的Cot值5核酸的分子杂交核酸分子杂交技术是目前分子生物学中应用很广的技术，它可以鉴定核酸分子之间的同源性，是分子克隆技术的重要组成部分。5.1分子杂交（简称杂交，hybridization）是应用核酸分子的变性和复性的性质，使两条来源不同的具有一定同源性（即具有碱基互补关系）的DNA单链分子或DNA单链分子与RNA分子经退火形成双链DNA分子或DNA-RNA异质双链分子（heteroduplex）的过程。杂交双链可以在DNA与DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成。杂交首先透过加热或碱处理使双螺旋解开成为单链，然后在一定条件下使互补核酸链实现复性。5.2杂交技术简介southern:用DNA作为探针杂交DNA。检测目标DNA的存在与否northern:用DNA或