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Plantregenerationviasomaticembryogenesis

andshootorganogenesisfrom

immaturecotyledonsofCamellianitidissimaChi

金花茶未成熟子叶体细胞胚胎发生、芽器官发生及植株再生的研究

JournalofPlantPhysiology170(2013)

1202–1211报告人：摘要

金花茶（山茶科）是世界著名的经济观赏植物，花为金黄色。在中国它属于稀有和濒危植物。本文的目的是诱导金花茶体细胞胚胎发生，芽器官发生并使植株再生。在改良的WPM培养基上附加不同植物生长调节剂得到三种类型的愈伤组织（白色，红色和黄色）。在这些愈伤组织中，白色愈伤组织，是4.5µm2,4-D诱导的，红色和黄色愈伤组织是由高浓度的细胞分裂素诱导的，TDZ或6-BA单独或结合弱活性的生长素NAA。胚性愈伤组织可以分化成体细胞胚，球状胚性结构或不定芽，这取决于在WPM培养基上用的植物生长调节剂。6-BA是最好的芽诱导激素，ZT是最好的体细胞胚诱导的激素，KT是最好的诱导球状胚性结构形成的激素。三种再生途径往往发生在同一块胚性愈伤组织团上。大多数芽（80%）在WPM添加IBA24.6µm和NAA0.3µm根系发达。而47.5%的体细胞胚能直接萌发，在诱导培养基中添加0.9µm6-BA和0.1µmNAA。球状胚性愈伤组织，可在两个分化途径：芽器官发生和体细胞胚胎发生，进行周期性的培养。由芽生根获得的植株和体细胞胚萌发得到的植株均移植到温室土壤中；8周后，从芽培养得到的苗及体细胞胚发育的苗的存活率分别为66.7%和78.6%。概述

金花茶生长分布范围较窄，仅在海拔为50-650米的中国西南部和越南北部有分布（张任，1998），通常生长在阴暗潮湿的山谷常绿阔叶林里。花直径为5–10厘米，色泽金黄，被誉为“茶皇后”和“植物王国的大熊猫”（梁，1993）。金花茶在全球作为一种重要的山茶物种和非常宝贵的品种选育资源已被介绍到日本、澳大利亚和美国北部作为遗传资源进行商业化种植。近年来，金花茶的花被鉴定出有多酚类抗氧化剂的存在引起了研究者的关注（Song等人，2011；万等人，2011）。由于人为破坏增加，自然更新缓慢，其自然种群数量近几十年来已经大大下降，现在列为中国一级濒危植物（兴，2005）。这种植物的濒危机制和相关遗传多样性已被广泛的研究（唐等人，2006；韦等人，2008a，2008b。；陈等人，2010；魏等人，2010）。

在自然环境中，金花茶唯一繁殖途径是种子繁殖（杨等人，2008）虽然无性繁殖存在一些研究，包括扦插和嫁接（郭等人，2008；江等人，2010）。相同的山茶属植物体细胞胚胎发生和器官发生也有报道（卫特斯等人，1991；蒙代尔等人，2004；蒙道，2011）。最成功报道是山茶属植物滇山茶的子叶诱导体细胞胚胎发生并获得了再生植株。然而，关于金华茶的组织培养并成功获得再生植株的报道，尚未存在。尽管我国的自然保护区已对金花茶进行了保护，但用传统的繁殖方法繁殖速度慢，对母树有破坏，而相对的组织培养能够解决这些问题，因此本研究是要用未成熟合子胚的子叶为外植体，通过三种不同的途径（芽器官发生，球形胚性结构，体细胞胚）建立一个有效的高频率的再生体系。材料与方法实验材料

连续三年在七月初（2009-2011年），金花茶的未成熟果实在5月左右从成年树上采摘，地点是中国广州，南方植物园。

除去果皮，取出未成熟的种子，在0.1％HgCl2（升汞）水溶液消毒8分钟，在无菌蒸馏水中冲洗5-8次，然后用解剖刀剥去种皮。

早期合子胚萌发是在改良WPM（麦科恩和劳埃德，1981年），不添加任何植物生长调节剂。这种基本培养基里含有3％蔗糖和凝固剂用0.7％琼脂（Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，美国），溶解并分装到高10厘米和直径6厘米的培养瓶里。pH调整为5.9，在121℃的高压灭菌锅里灭菌15min。培养物放在14小时的光培养，温度为25±2℃的培养箱里。这些培养条件同于所有的实验中，除非另有说明。

2周培养后，由未成熟合子胚发育的子叶作为外植体。愈伤组织诱导和继代培养过程中的褐化防治

培养期间，附加不同添加剂和光照条件下进行比较愈伤组织诱导和继代培养抑制褐变和评估褐变能否被更好的抑制。改良WPM培养基中附加2.3µmTDZ和活性炭（AC;0.5，3.0g/L）2或硝酸银（AgNO3;5.0，10.0,15.0，20.0mg/L）。在黄色愈伤组织的诱导和继代培养，分别在高的光强度，自然光，或暗。每种处理有30个外植体，每个处理重复三次。培养物每周观察，超过5周。选择出最好的防褐变方法。子叶诱导愈伤组织

用解剖刀切下合子胚子叶产生的愈伤组织接种在改良WPM基本培养基里，附加20mg/LAgNO3和植物生长调节剂，诱导愈伤组织（表1）。TDZ、GA3、IAA、和ZT是过滤器（0.24µm）灭菌并加入灭菌冷却的培养基里。而6-BA，IBA，KT，以及NAA高压灭菌前就加入到培养基里。每组30个外植体，并且所有的实验重复三次。每月观察愈伤组织的诱导率，以百分比表示。9周培养后，对诱导的愈伤组织进行了分析研究。

诱导胚性愈伤组织

附加9.0µm的6-BA和1.0µm的NAA产生的黄色胚性愈伤组织转移到附加20mg/LAgNO3，NAA（0.3或

0.1µm）结合KT（2.3或9.0µm）、6-BA（2.3或9.0µm）、TDZ（2.3µm）和ZT（2.3或9.0µm）的改良的WPM基本培养基中（表2和3）观察愈伤组织分化情况。

芽的伸长与增殖

胚性愈伤产生的不定芽转移到改良WPM培养基附加20mg/LAgNO3，6-BA(0.9,2.3,9.0,22.5µm),和NAA(0.1,0.3µm)里进行芽伸长和增殖试验（表4）。每个处理30个芽，重复3次。每月观察并记录数据，共16周。不定芽增殖系数为接种后不定芽数量/接种前芽数量。

生根及驯化

芽的高度达到3-4厘米时,切下，转移到附加20mg/LAgNO3和和附加单一植物生长调节剂，IBA(5.0、49.2µm)和NAA(0,2.5µm),诱导生根。培养5-7周后，根形成。在培养基上培养8周后，植株达到4-6片叶和5-7厘米，从培养瓶中取出，把琼脂清洗干净，60个植株移植到花盆里，黄土：泥炭：蛭石=1:1:1。花盆放在遮光率为90%的棚内。每天浇水。8周后，统计存活率。体细胞胚萌发为完整植株

体细胞胚的培养和萌发是在附加20mg/LAgNO3,0.9µm

6-BA和0.1µmNAA的培养基里。培养13周后，研究植株再生率。60个植株移植到花盆里，黄土：泥炭：蛭石=1:1:1。花盆放在遮光率为90%的棚内。每天浇水。8周后，统计存活率。球状胚性结构组织学研究

研究球状胚性结构的个体发生和发育过程，球状胚性结构是在培养基里附加2.3µmKT产生的，将培养物暗培养三十天后，转移到弱光照条件下培养。将培养2、4、6、8、10、12周的愈伤团用FAA固定液固定，在室温下放置超过24小时。然后将样品转移到酒精中进行一系列的脱水处理，用苏木精着色，用石蜡包埋。用旋转式薄片切片机切成8-10µm的薄片，压片，在显微镜下观察并拍照。不同基本培养基对胚性愈伤分化的影响

比较MS培养基和改良WPM培养基对胚性愈伤组织分化的影响，在培养基里加入相同的植物生长调节剂和AgNO320mg/L做对比试验,观察并记录结果。包括不定芽，体细胞胚的发生数量。数据分析

所有的实验重复三次，每隔两周重复一次。每种试验处理有五个培养瓶，每个培养瓶里有六个外植体。实验设计为正交试验，数据用SPSS软件分析处理。

在愈伤组织诱导期间会产生褐化现象，光照强度大，增加褐化现象，随光照强度的减弱，褐化现