姜黄提取物的质量分析方法研究

姜黄提取物的质量分析方法研究

姜黄是姜科植物的一种干燥的幼苗。提取物的主要成分是类黄酮类化合物（curcumin，1）、抗胆红素（2）和二羟色胺（3）（图1）。它具有抗诱导、抗癌、降血脂、肝脏、胆囊等药理活性。但3种成分药理活性有所不同,如抗诱变、抗癌方面,以姜黄素活性最强,而利胆、护肝方面,二甲氧基姜黄素活性最强。此外,姜黄素类成分作为天然色素,还广泛应用于食品工业中。因此,姜黄提取物质量评价方法研究对药品及食品质量标准的建立和质量控制是必要的。关于HPLC、UV法法测定姜黄素类化合物含量研究已有较多报道,而文献中在254nm测定波长下建立的HPLC法分离度及灵敏度欠佳。为此,本研究建立了HPLC法在425nm波长下测定上述3种姜黄素类成分,提高了检测灵敏度和分离度,并与UV法测定的总姜黄素含量比较,旨在为姜黄提取物质量标准化研究提供科学依据。1仪器和检测方法UV-2201紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);高效液相色谱仪:LC-6A型泵,SPD-10Avp型紫外-可见检测器,CTO-6A型柱温箱(以上均为日本Shimadzu公司产品),N-2000色谱工作站(浙江大学人工智能信息研究所);AG-245电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司);DL-360超声波清洗仪(浙江象山县石浦海天仪器厂);H-26F型离心机(Kokusan公司,日本)。甲醇(色谱纯,山东禹王实业有限公司禹城化工厂),乙腈(色谱纯,天津市四友生物医学技术有限公司),水为重蒸水,其余试剂均为分析纯。姜黄素对照品购于中国药品生物制品检定所,去甲氧基姜黄素和二去甲氧基姜黄素对照品由本研究室从姜黄药材分离制备,由光谱解析确定结构,HPLC面积归一化法测定纯度均达到98%以上。商品姜黄提取物:GL(山东省绿叶制药有限公司);GK1和GK2(日本Kanebo汉方药研究所);GC(日本冲绳制粉株式会社);GW1和GW2(日本丸善制药株式会社)。2方法2.1理论塔板数和细度色谱柱:KromasilC18(250mm×4.6mm,5μm,天津开发区色谱分析仪器有限公司);流动相0.01mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液-乙腈(50:50,pH=2.5);检测波长:425nm;柱温:35℃;流速:1.2mL·min-1;进样量:10μL;检测灵敏度:0.02AUFS。理论塔板数按姜黄素、去甲氧基姜黄素、二去甲氧基姜黄素峰计算均为10000以上。3种组分之间分离度大于1.5,拖尾因子在0.8-0.9之间。2.2姜黄提取物的hplc法精密称取姜黄提取物GL0.01g,GK1和CK2各0.02g,GC1.0g,GW1和GW2各0.06g,分别于100mL棕色量瓶中,加75%甲醇20mL,超声波(42kHz,15min)提取,放冷,加75%甲醇稀释至刻度,摇匀,0.45μm微孔滤膜滤过,即得(HPLC法)。精密称取姜黄提取物GL0.01g,GK1和GK2各0.02g,GC0.5g,GW1和GW2各0.06g,分别于250mL棕色量瓶中,加75%乙醇20mL,超声波(42kHz,15min)提取,放冷,加75%乙醇稀释至刻度,摇匀;分别精密吸取上述各上清液1mL,置10mL棕色量瓶中,加75%乙醇稀释至刻度,摇匀,滤过,即得(UV法)。2.3对照品溶液的制备精密称取姜黄素对照品2.0mg及去甲氧基姜黄素对照品、二去甲氧基姜黄素对照品各1.0mg,于20mL棕色量瓶中,加甲醇溶解、定容,摇匀。精密吸取该溶液0.5,1.0,2.0,4.0,8.0mL,分别置10mL棕色量瓶中,加甲醇定容,摇匀,0.45μm微孔滤膜滤过,即得各浓度对照品混合溶液(HPLC法)。精密吸取各浓度对照品混合溶液10μL,按2.1项下色谱条件进样分析,重复测定3次,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。结果表明姜黄素、去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素在相应的浓度范围内线性关系良好。回归方程分别为:精密称取姜黄素对照品1.0mg,于20mL棕色量瓶中,加75%乙醇溶解、定容,摇匀。精密吸取该溶液0.2,0.5,1.5,2.5,3.5mL,分别置25mL棕色量瓶中,加75%乙醇定容,摇匀,即为各浓度对照品溶液(UV法)。取各浓度对照品溶液,以75%乙醇为空白,在425nm波长处测定吸光度,每个样品测定3次,以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,结果表明,在0.396-6.930mg·L-1浓度范围内线性关系良好,回归方程为2.4各供试品成分含量精密吸取各供试溶液(HPLC法)10μL,按2.1项色谱条件进样分析,每个样品测定3次。由各供试溶液所测得峰面积,根据回归方程式,计算供试品中姜黄素、去甲氧基姜黄素、二去甲氧基姜黄素含量,总姜黄素含量为3成分含量之和。取各供试溶液(UV法),以75%乙醇为空白,在425nm波长处测定吸光度,每个样品测定3次,根据姜黄素回归方程式,计算供试品中总姜黄素含量。3结果3.1测定波长的确定姜黄提取物供试溶液最大吸收波长为(425±1)nm,UV测定波长选择为425nm(图2);由姜黄素、去甲氧基姜黄素、二去甲氧基姜黄素对照品溶液紫外扫描图谱,可见各自最大吸收波长分别为430,418,414.5nm,从检测灵敏度和分离度考虑,同时为了与UV法测定结果比较,选择425nm为HPLC测定波长。在流动相0.01mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液-乙腈(50:50,pH=2.5),流速1.2mL·min-1的洗脱条件下,供试液中姜黄素、去甲氧基姜黄素、二去甲氧基姜黄素色谱峰与相邻峰均达到基线分离,峰形对称,保留时间(tR)分别为13.6,12.3,11.2min(图3)。3.2方法的进样测定精密吸取对照品混合储备液(HPLC法)和姜黄提取物GK1供试溶液(HPLC法)各10μL,按2.1项下色谱条件进样分析,重复测定5次,3指标成分峰面积值RSD分别为0.3%-0.8%,供试样品中其峰面积值RSD为0.8%-1.2%。取姜黄素对照品溶液(UV法,浓度6.930mg·L-1)和姜黄提取物GK1供试溶液(UV法),在425nm波长处测定吸收度,重复测定5次,吸收度值RSD均为0.1%。3.3重复性测定结果取姜黄提取物GK1,按2.2项下制备5份供试溶液(HPLC法),按2,1项下色谱条件进样分析,每份样品重复测定3次,并计算姜黄素、去甲氧基姜黄素、二去甲氧基姜黄素含量,RSD分别为1.6%-1.9%,重复性良好。取姜黄提取物GK1,按2.2项下制备5份供试溶液(UV法),在425nm波长处测定吸收度,每份样品重复测定3次,并计算总姜黄素含量,RSD为1.2%,重复性良好。3.4稳定性试验取对照品溶液姜黄素(0.27mg·mL-1)、去甲氧基姜黄素(0.24mg·mL-1)、二去甲氧基姜黄素(0.28mg·mL-1)及姜黄提取物GK1供试溶液(HPLC法),分别于棕色瓶中保存,于0,1,2,4,6,8h按2.1项色谱条件进样分析,重复测定3次,其峰面积值RSD为0.7%-2.0%,结果表明,于棕色量瓶中保存的对照品溶液和供试溶液在8h内均有良好的稳定性。3.5加样回收率试验精密称取已知含量姜黄提取物GK110mg,共3份,精密加入姜黄素(0.148mg·mL-1)、去甲氧基姜黄素(0.054mg·mL-1)及二去甲氧基姜黄素(0.058mg·mL-1)对照品混合溶液10mL,按2.2项下制备HPLC法加样回收率试验供试液,依法测定,HPLC法回收率在96.3%-97.7%。精密称取已知含量的姜黄提取物GK110mg,共3份,精密加入姜黄素对照品溶液(0.27mg·mL-1)10mL,按2.2项下制备UV法加样回收率试验供试液,依法测定,计算姜黄素回收率为99.4%,结果见表1。3.6样品含量的测量分别以HPLC法和UV法测定了6种姜黄提取物商品中3种姜黄素指标成分及总姜黄素含量,结果见表2。4姜黄素类化合物的hplc分析方法的应用4.1通过与文献报道的四氢呋喃-水-冰醋酸(36:56:8)、乙腈-水-冰醋酸(45:55:9.6)、甲醇-异丙醇-水-冰醋酸(20:27:48:5)等流动相系统对比试验,结果表明,本研究采用0.01mol·L-1磷酸二氢钾-乙腈流动相系统明显改善了姜黄素类化合物分离度,提高了定量结果准确性。4.2文献报道姜黄素类化合物的HPLC分析法,采用254nm为检测波长。本研究比较紫外吸收光谱图发现,3种姜黄素类化合物414-430nm处吸收度比236-247nm处高3倍以上,为此,采用425nm作为HPLC检测波长,即提高了检测灵敏度,且克服了文献方法中进样量大,有杂质干扰等缺点。4.3本研究中,HPLC法和UV法测定样品GC中总姜黄素含量分别为0