双向电泳技术的研究进展

双向电泳技术的研究进展

2001年2月15日，全球人类共同事件序列的完成意味着人类将进入后半部分的基本组时代。基因组时代的研究发现,在揭示基因组精细结构的同时,也显示出基因数量的有限性和基因结构的相对稳定性,这与生命现象的复杂性与多变性之间存在着巨大反差。这种反差的存在使人们认识到,要研究生命现象,仅仅研究基因组的结构是远远不够的,必须对生命活动的直接执行者-蛋白质的重要性有更深刻的了解,因此,一个以“蛋白质组”为研究重点的时代已悄然到来。“蛋白质组”一词的英文是PROTEOME,由PROTEins和genOME两个词组合而成,这一概念是由澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams在1994年提出的,是指基因组表达的全部蛋白质,广义上讲,蛋白质组是指“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。作为研究蛋白质组的三大核心技术之一,(另外两种分别是计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术)。双向电泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)是目前唯一可将数千种蛋白质同时分离的方法,双向电泳技术联合质谱鉴定技术被公认为是目前蛋白质组研究技术的标准方法本文拟就双向电泳技术各个步骤的最新进展做一综述。1elp技术原理双向电泳,又称作双向凝胶电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis),由O′FarrelPH最早建立于20世纪70年代。该技术用于蛋白质的分离,其操作步骤分为两步,第一步称作等电聚焦(isoelectricfocusing,IEF),这一步的原理是将蛋白质根据pH梯度分离至各自等电点,通过电荷来分离蛋白质;第二步是十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)第二次分离是根据蛋白质分子量大小的不同将其在与第一向垂直或水平方向上分离。2蛋白质抽提过种的制备方法如何从细胞组织中尽可能完整地,并且尽可能多的将蛋白质以溶解状态提取出来,是蛋白质组研究的首要步骤。样品制备最基本的三个步骤是,组织或细胞的破碎,失活或者去除干扰物质,蛋白质增溶溶解。由于蛋白质不能溶化也不能蒸发,其所能分配的物相仅限于固相和液相,并在这两相间交替进行分离纯化。因此在制备样品的过程中,就只能利用蛋白质在此两相中分配率的不同来提取。在蛋白质抽提过种中,有几条共同的原则需要遵循:一是尽可能多溶解全部蛋白质,打断蛋白质之间的非共价键结合,使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在;二是避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的降解作用;三是避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用;四是蛋白质样品与第一向电泳的相容性。2.1细胞或组织的破裂细胞破碎主要采用机械,物理和化学的方法进行。由于细胞在破碎时会释放出蛋白酶,因此加蛋白酶抑制剂。常用的细胞破碎方法有如下3种。2.1.1高速转动的嫌犯刀主要通过机械切力作用使组织细胞破坏。常用器械有:①高速组织捣碎机(转速可达10000r/min,具有高速转动的锋利的刀片),尤其适用于动物内脏组织的破碎;②玻璃匀浆器,用两个磨砂面相互磨擦,将细胞磨碎,适用于少量材料,也可用不锈钢或硬质塑料等,两面间隔只有十分之几毫米,对细胞破碎程度较高速捣碎机高,机械切力对分子破坏较小。2.1.2样品的预处理主要通过各种物理因素的作用,使组织细胞破碎。常用的方法有:①反复冻融法:现在使用的方法主要是将样品在液氮中冻结后,迅速融解,再冻结,再融解,如此循环多次,由于渗透压的变化,使结合水冻结产生组织的变性,冰片将细胞膜破碎,使蛋白质可融化,成为粘稠的浓溶液。以前也有将样品在冷藏库或干冰中反复冻融的;②超声波法:属于较强烈的破碎方法,因为超声过程中会产热,所以要求在冰浴上进行,间歇处理,不同的样品选择不同的功率;③研磨法:将样品加入瓷钵中,然后加液氮研磨成粉末。上述3种方法是物理方法中最基础的,其余的方法均是在此3种方法上的衍变,其最基本的原理是一样的。2.1.3液体辅助破碎细胞化学方法使用较少,主要是加入一些化学物质,利用化学反应达到分离蛋白的作用。常用的方法包括:①有机溶媒法,多在0℃以下加入5~10倍量的丙酮,迅速搅拌均匀,可以破坏细胞膜,也可以破坏蛋白质与脂质的结合;②自融法,将待破碎的新鲜材料在一定的pH和温度下,利用自身的蛋白酶将细胞破坏,使细胞内含物释放出来;③酶法,用一些蛋白酶除去变性的蛋白质。与机械方法和物理方法相比,化学方法使用较少。2.1.4蛋白酶抑制剂①为避免因为蛋白质变性后在最后的图像上引起伪点和大分子量蛋白的丢失,应该使用蛋白酶抑制剂;②盐离子会干扰电泳分离的过程,如果它们的浓度太高,大于100mmol/L就应该去除;③多糖和核酸可以与载体两性电解质以及蛋白质发生作用,并且会在2-D胶上引起条纹,所以要去除。2.2溶解过程控制经过细胞破碎及干扰物质的去除之后,个别的多肽要通过变性和还原来破坏分子内或分子之间的相互作用,而且在溶解过程中还要保持内在电荷的特性。样品溶解经常是在缓冲液(又称裂解液)中进行,无论裂解液组成如何变化,其各个组份都应该包含最基本的3种物质,分别是离液剂(又称促溶剂),去垢剂(又称表面活性剂)和还原剂。这3种物质在样品裂解液中的作用是无法使用其他物质来替代的。2.2.1离液剂的种类离液剂的作用是来破坏氢键等次级键的结构,使蛋白的肽链伸展开来,充分暴露疏水中心,降低接近疏水残基的能量域。目前最常使用的离液剂是硫脲(thiourea),由Rabilloud首先介绍,硫脲非常适合用来打断氢键之间的疏水作用,但是硫脲的不足之处在于其在水溶液中溶解性太差,因此限制了它的单独使用。但是硫脲在一定浓度的脲溶液中溶解性增强,目前,最好的解决方法就是将此二者联用,5~7mol/L脲与2mol/L硫脲与合适的去垢剂联用,可以增强蛋白溶解的效果。2.2.2非离子或两性离子去垢剂去垢剂的作用在于破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用。最常使用的去垢剂包括阴离子去垢剂SDS,非离子去垢剂TritonX-100和NP-40,两性离子去垢剂CHAPS等。阴离子去垢剂SDS是最有效的表面活性剂之一,有人建议在沸腾的SDS溶液中进行蛋白溶解。如果样品在1%的SDS溶液中溶解而没有在至少4倍的(脲或硫脲)裂解液中稀释,使用非离子或两性离子去垢剂来代替阴离子去垢剂SDS,使其的浓度降在0.2%以下,就会在2-D图像中观察到水平的条纹。因为2-DE上样量的严格要求与为获得SDS的足够稀释之间的矛盾,现在越来越多的使用非离子去垢剂和两性离子去垢剂。最常使用的阴离子去垢剂是NP-40,TritonX-100和十二烷基麦芽苷。不足之外是TritonX-100和NP-40在溶解疏水性极强的膜蛋白不是十分有效。与之对比,两性离子去垢剂如CHAPS,硫代甜菜碱在溶解膜蛋白方面作用更强。更精细的研究揭示,两性离子去垢剂在溶解疏水性蛋白的有效性方面的原因,不仅是由于蛋白质本身的特性,而且还在于一些其它物质的特性,特别是样品中的脂质物。即便取得了很大的进步,研究表明,不存在任何一种单一溶液能解决复杂的蛋白溶解问题。多数膜蛋白不能在单一的非离子去垢剂或两性离子去垢剂完全溶解,改善裂解液的配方,来提高膜蛋白的溶解度,仍然是非常重要的工作。2.2.3硫代赤藓醇还原和防止二硫键的再次氧化也是样品制备的一个关键步骤。还原剂在清除分子间或分子内二硫键的相互作用,维持蛋白分子保持断裂方面起重要作用。最常使用的还原剂是二硫苏糖醇(DTT)或者二硫代赤藓醇(DTE),这两种还原剂的用量都较大,浓度要高于100mmol/L。DTT本身还带有电荷,在等电聚焦时,常常会迁移到pH范围以外,从而使某些二硫键重新配对,使溶解度降低而重新沉淀下来。Herbert等人最先建议使用非离子型还原剂三丁基磷(tributyl-phosphine,TBP)来替代DTT和DTE。因为TBP化学反应的原因,其应用浓度非常低,仅2mmol/L,而且可以大大增加蛋白质的溶解性,并可帮助蛋白质从第一向转移到第二向。TBP的不足之处在于其在水溶液中的溶解度太差以及半衰期过短。2.2.4分步提取法:提取和细胞对于细胞的表达,是根据克对全细胞蛋白质进行预分离(pre-fractionation)是提高低丰度蛋白质和膜蛋白检出限的有效方法。一种是被称为分步提取法,其原理是基于蛋白质的溶解度不同,采用3种不同的提取液对全细胞蛋白质进行分步提取和分别电泳。还有一种预分离的方法称为多间隔电解法,此种方法实质上是一种制备等电聚焦的方法。3固相ph梯度法分离金属离子蛋白质组研究的先决条件也是最大的挑战就在于从复杂的生物样品中将蛋白质分离出来,并且要求有很高的重复率和分辨率。O′Farrell′s最先发明的载体两性电解质(carrierampholyte,CA)双向凝胶电泳技术成为了世界范围分离复杂样品蛋白质的标准方法,但是,该方法即使在同一个实验室也很难获得重复的结果,更不用说不同实验室之间的结果比较。重复性差的原因主要在于合成的CA,比如梯度不稳定,聚焦时间过长,阴极漂流,不同时间制备的CA之间的变异等等。在实际应用中,由CA产生的pH梯度很少能超过pH7.5,其结果将是碱性蛋白的丢失。真正的一向等电聚焦技术的突破是在Immobilines试剂的基础上开发的固相pH梯度(immobilizedpHgradient,IPG)技术。IPG技术在很大程度上解决了重复性差的问题。3.1解决酸性及碱性蛋白检出率的问题第一向等电聚焦是根据蛋白质等电点的不同将其分离,为提高分辨率和蛋白质的检出率,必须不断改进胶条。一方面是胶条的pH范围,在不断变窄的同时也在不断的扩大。目前相差一个pH范围的窄胶条及pH3~12的胶条均已有商品化,这些胶条的出现,极大的改善了酸性及碱性蛋白的检出率。另外一方面是胶条长度的改变,目前有7cm,11cm,13cm,18cm及24cm,18cm有胶条是目前最常用的一向IEF胶条。有报道称,使用更长的胶条可以增加蛋白质的分辨率和检出率。上样量根据考染或银染及实验目的不同而不同,一般来说考染要求的上样量较大。理论计算,2-D图谱上将会有30%的碱性蛋白其等电点在pH12以上。对于极碱性蛋白的分离,宽pH范围,如3~12或是4~12的IPG胶条更适合。在第二向分离之前需要进行平衡,平衡的目的是通过平衡液中的DTT或β-巯基乙醇使蛋白质分子中的二硫键保持还原状态,有利于SDS与蛋白质的充分结合。3.2凝胶的分离和石镜的制备SDS可以在水平或垂直两个方向进行。水平胶可利用预制胶在自制平板胶运行,水平胶的优点是凝胶附着在塑料支持膜上,在染色过程中可以防止凝胶大小发生变化,水平胶分离蛋白的边缘要比垂直胶清晰,此外,蛋白质点的分布变形程度小。水平胶不能同时运行两块胶,所以,为了同时运行获得图谱的重复性,就要用垂直电泳。较之一向等电聚焦的变化来说,二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳自从问世以来,其变化不大。4蛋白质鉴定法二维电泳后分离得的蛋白质常规检测和定量的普遍方法是考马斯亮蓝染色和银染。这两种染色方法相比,考染法具有染色过程简单,所需配制试剂少,操作简便,无毒性,染色后的背景及对比度良好,与下游的蛋白质鉴定技术相容等优点,但是其不足之处在于灵敏度低,检测蛋白的极限是8~10ng,对于低丰度蛋白难以显色。银染法的特点相对于考染法来说,优点是灵敏度高,可达200pg,但其不足之处在于操作过程烦琐,而且染色过程中醛类的特异反应,使得对凝胶酶切肽谱提取存在困难,进行质谱鉴定之前增加了脱银的步骤。随着质谱鉴定灵敏度的不断提高,考染和银染法用于蛋白质组研究中的局限性逐渐暴露出来,新的染色方法,如荧光染色,同位素标记,负染法等等不断出现,新方法的出现,都是从两个方面在改进,第一,提高蛋白检测的灵敏度,第二,增加与下游质谱鉴定的兼容性。5蛋白分离和活性发展双向凝胶电泳技术在目前仍然是蛋白质组研究不可替代的分离方法,有很