慢病毒载体的功能与改性

慢病毒载体的功能与改性

目前，反向重组中的病毒载体已被用作基因治疗和其他研究领域的常用基因转移工具。慢病毒为一类逆转录病毒的总称,由慢病毒改建而来的载体系统以其高效而稳定的基因转移效率成为近来研究者们的常用选择。与其他逆转录病毒载体相比,慢病毒载体主要有以下几个优点:其一:慢病毒载体既可以转染处于有丝分裂活跃期的细胞,又可以转染分裂缓慢及处于分裂终末期的细胞,包括造血干细胞,神经干细胞,处于分化终末的神经元,肝实质细胞等;其二:由慢病毒载体携带整合入宿主基因组的目的基因对转录沉默作用有较强的抵抗能力,在体外培养细胞实验和体内移植实验中,由慢病毒载体携带导入的目的基因可以在宿主细胞中得到长期而稳定的表达;其三:慢病毒载体可以兼容多个转录启动子,包括细胞特异性启动子和在基因组中普遍存在的管家基因的启动子;其四:经过改建后的慢病毒载体可以容纳约10kb左右的外源基因,因此大多数的cDNA都能被克隆入慢病毒载体。慢病毒载体的上述优点使其成为体内和体外基因转移的一种有效工具。1慢病毒载体基因整合原理慢病毒载体根据其来源不同,主要有以下几种类型:HIV-1型(humanimmunodeficiencyvirustype1)载体系统,HIV-2型(humanimmunodeficiencyvirustype2)载体系统,猿类免疫缺陷病毒(simianimmunodeficiencyvirus,SIV),猫免疫缺陷病毒(felinesimmunodeficiencyvirus,FIV)等。其中HIV-1型载体系统研究得最为广泛和深入。HIV-I型慢病毒载体构建过程与其他逆转录病毒载体的构建原则相似,在研究应用过程中,HIV-I型慢病毒载体通过改建逐步去除了野生型病毒基因组中的致病基因,并完全去除了3′端LTR中的U3序列,使LTR区的转录激活能力下降,成功构建了自我灭活型载体系统(self-inactivationvectors,SIN)。这一系统保留了野生型病毒(图1)基因的顺式作用元件LTR,包装信号(φ),及Rev基因的反应元件。去除了vif,vpr,vpu,nef等致病基因,保证了载体的生物安全性。将编码病毒衣壳和包膜结构的基因分别克隆于另外两个质粒中,通过三个质粒共同转染包装细胞产生完整的病毒颗粒。也就是说,慢病毒载体系统主要由三种包含不同结构的质粒构成,分别是转移质粒(transfervectors),辅助质粒(helperplasmids),包膜表达质粒(envelopexpressionplasmids)。结构如图2。其中,转移质粒除包含我们感兴趣的外源基因外,同时还保留了病毒的LTR区和其他对病毒的整合复制起重要作用的元件。其中LTR区包含了慢病毒的启动子、增强子、包装信号、整合位点(attachmentsite,Att)等结构。包装序列能够使识别病毒RNA将其衣壳化并装配到病毒颗粒中,Att位点使病毒基因可以整合入宿主基因。同时转移质粒中还加入了内部启动子驱动外源基因转录。辅助质粒整合进入包装细胞后表达蛋白多聚体gag,编码病毒的衣壳蛋白及病毒的其他模序结构(matrixstructure),同时表达蛋白pol,pol蛋白具有逆转录酶及整合酶的活性,负责对病毒载体基因的结构元件进行切割,促使载体基因整合入宿主细胞基因组中。包膜质粒中用口腔炎疱疹病毒的包膜蛋白基因(VSV-G)取代了HIV-1型病毒的env基因,由于VSV-G受体广泛存在于多种细胞表面,使慢病毒载体的宿主细胞倾向性大大增加。2现阶段，缓慢病毒载体的设计正在开展为进一步提高载体的应用范围和生物安全性,现阶段研究者对载体的结构作了进一步的改进,主要包含以下几个方面。2.1最佳载体的研发由于SIN型慢病毒载体去除了大部分的HIV-IU3区自身的启动子,为了驱动外源基因的转录,一些实验室在U3区插入了外源性的启动元件代替了U3区本身的启动结构。这种改建的成功使得在U3区插入的外源启动子和外源基因可以有效表达,也使得在慢病毒载体中同时表达两种外源基因成为可能。因此,现阶段应用的慢病毒载体可以同时克隆入外源基因,抗生素筛选基因以及荧光标记。这一方面的改进对于体外细胞水平的基因表达研究和在体的基因治疗研究都具有重要意义。另外,设计者们也通过这种改建认识到可以通过更多地去除U3区的部分序列来提高载体的生物安全性。一些实验室将loxP位点插入到了3′LTR的U3区,载体完成逆转录和整合的过程后,loxP位点也会通过复制出现在5′LTR区,这样载体中的转入基因就会嵌入在两端的loxP位点之间,这种设计一方面可以通过加入cre使两端的loxP位点发生环化从而使转入的外源基因沉默,提供了一种外源基因条件性表达的可能,同时也为转入外源基因可能对组织或细胞产生副作用提供了安全保障。2.2逆转录相关基因表达增加由于病毒载体的基因组结构是随机整合入宿主基因组中的,整合部位宿主基因的调控元件会对整合入的外源基因表达起抑止作用。这种作用也被称为位置效应(positionaleffect)。引发这种效应的原因最初被认为是cpG胞嘧啶核苷二聚体的甲基化以及组蛋白脱乙酰作用所引起的染色体凝聚。后来在在利用逆转录病毒对干细胞进行基因转移的研究中发现,不同的细胞中可能存在一种细胞特异性的转录沉默因子,这种因子在甲基化作用发生之前使基因表达处于静息状态。目前研究者主要通过以下几种途径来削弱这种效应。一是删除已知的逆转录病毒沉默元件。最近有研究表明,应用HIV-1型慢病毒载体转染鼠类细胞,转录沉默作用仅发生在非SIN型载体系统中,分析原因可能是非SIN型载体仍然保留有LTR区的转录起始元件,而这种元件会对整个载体基因在宿主基因中的转录起始起干扰作用。二是加入正向调控元件来增强转移基因的表达。目前这些正向调控元件主要包括局部调控元件(localcontrolregion,LCR),染色质绝缘体(chromatininsulator),模序结合位点(matrixattachmentsites)。如DNaseI高敏感性位点(highpersensetivesites,HS)是位于β-球蛋白基因簇上游的LCR,这一区域游离于核小体之外,对反式作用元件的亲和性较高,并可以协调位点独立性表达和复制依赖性表达的关系。有研究证实将这一区域插入慢病毒载体可以提高β-球蛋白基因在转基因鼠中的表达。插入染色质绝缘体(chromatininsulator)也可以提高目的基因的表达。模序结合位点是介导单个染色质茎环结构与类似蛋白质的模序黏附结合的区域。将这一序列插入载体明显提高了转染效率和转入基因的表达时间。这些调控元件的发现为构建慢病毒载体,使目的基因在靶细胞中持续高效表达提供了依据。2.3通过外源基因引导基因型的基因表达病毒载体携带的外源基因转入宿主细胞后是否能够表达还与启动外源基因的启动子及宿主细胞的类型均有关系,一般类型的慢病毒载体都选用管家基因的启动子来启动外源基因以保证其有效转录。研究者由此想到了应用靶细胞特异性表达基因的启动子作为载体外源基因的启动序列,从而使转入的外源基因只在特定类型的细胞中表达。有研究报道,利用星形胶质细胞的特异性表达蛋白GFAP的启动子构建的慢病毒载体在注入动物模型的受损脑区后,其携带的外源基因特异性地在星形胶质细胞中表达,并且外源基因的表达水平可以伴随内源性GFAP基因的激活而得到调节。这一技术也被应用于生产不同组织特异性表达GFP的转基因动物,其方法是利用含不同组织特异表达蛋白启动子的慢病毒载体转染胚胎细胞,如果胚胎发育成功,特定的组织细胞会呈GFP阳性。应用组织特异性的启动子和增强子来驱动慢病毒载体中的外源基因能够使其在特定的组织细胞中表达,这一进展为慢病毒载体介导的基因靶向性治疗提供了理论基础。2.4tet-oh转录调节系统如何使慢病毒载体携带的外源基因根据机体的需要进行有效调节也是保证基因治疗的有效性和安全性的重要问题。目前应用最多、前景最好的是四环素调节系统,即tet-on及tet-off系统。这一系统是根据大肠埃希氏菌属TN10的四环素抗性操纵子的结构特点构建的,这一抗性操纵子包含一个四环素抑制蛋白(TetR)、一个特异性的DNA结合位点及四环素操纵序列(TetO)。无四环素存在的条件下,TetR呈二聚体状态并与TetO结合。四环素(tetracycline)或四环素类似物——强力霉素(doxycycline)可以与TetR结合使其构象发生改变,从而导致TetR与TetO分离。后来发现,TetR存在一种突变体结构,在这种突变体中决定TetR空间构象的四个核心蛋白发生了突变,形成了一种反式的空间构象,即当dox存在时,TetR呈二聚体结构结合于TetO上阻碍了下游基因的转录。利用四环素原核操纵将单纯疱疹病毒的转录激活域(VP16)与TetR或TetR的突变体融合分别组成四环素反式激活因子(tetracyclineresponsiveactivator,tTA)和rtTA(reversetetracyclineresponsivetransactivator)。为了在哺乳动物细胞中表达,研究者将CMV启动子与TetO重复序列融和,与tTA结合构成了Tet-off转录调节系统,与rtTA结合构成了tet-on转录调节系统。由于tet-off系统需要长期给予强力霉素来维持外源基因的表达,这对于终身的基因治疗不是一个理想的选择。同时,tet-off系统的诱导启动需要通过药理作用清除强力霉素,这一过程较tet-on系统的诱导过程要缓慢。因此,tet-on转录调节系统在目前基因治疗领域的应用更为广泛。目前应用的Tet-on基因调节系统多分别构建于两个质粒中,其中一个含有由外源启动子驱动的rtTA,另一个质粒中含有TRE及受其调控的外源基因。二者通过共同转染同一细胞来发挥TRE和rtTA间的调控作用,这一过程需要通过两步筛选来完成,即首先筛选出成功转染TRE的细胞群,再用含rtTA的质粒来转染TRE阳性的细胞群,然后通过第二次的分筛筛选出二者都转染成功的细胞群。这一系统更适合于体外的实验,在在体实验中的可控性较差。有研究者正试图将二者构建于同一载体中。但是,Tet-on系统不足之处在于背景效应的存在,所谓背景效应是指在四环素不存在的情况下,rtTA也会与TetO结合,这种情况会导致受其调控的蛋白表达量的下降,这对于在低剂量水平发挥作用的蛋白表达更为不利,如生长因子类蛋白。针对这一问题,有些实验室正对rtTA作进一步的改进,如经过改建后的反式转录激活因子rtTA2s-M26,经过TetR区的突变和遗传密码的优势选择,以及VP16区的激活域改建为含12个氨基酸的重复序列,其特异性、稳定性、可调性都得到了很大提高。它可以在四环素浓度较最初的rtTA低10倍的情况下发挥作用,在四环素不存在的情况下,没有背景效应的产生。并且外源基因的表达水平与四环素的浓度在一定范围内呈剂量依赖关系,即随着外源给予四环素浓度的增加,外源基因的表达量也会相应增加。因此,通过对rtTA的改建,对逆转录病毒载体中加入的外源基因表达水平可以进行准确的调节,使载体和外源基因的可控性更强,为慢病毒载体应用于临床打下了基础。最新型的四环素可调控系统与慢病毒载体相结合,使基因的条件性表达和基因敲除都成为可能,为探索基因的功能提供了有利的工具。Szulc等利用KRAB结构域(Kruppel-associatedbox)的结构和功能特点构建了一种新型的TET-on/off调控系统。接近三分之一的参与转录调控的锌指结构中包含KRAB结构域,当DNA与锌指结构相互作用时,KRAB结构域环化成为多分子复合体,引发组蛋白的脱乙酰作用和甲基化,从而导致染色体的变构而抑制转录激活。KRAB结构域与tetR结构相融合构成了转录激活抑制结构,研究者证实利用这种结构与四环素操纵子结构相互作用(图4)在体外细胞培养试验和在体试验中都能得到了更为严格的基因调控表达效果。3慢病毒载体的安全性分析现阶段将目的基因导入靶细胞和组织的方法主要包括真核表达质粒的转染,和病毒载体介导的基因转移方法等。其中真核表达质粒的转染对于分裂增殖比较旺盛的体外培养细胞转染效果较好,但表达的目的基因常常随时间的延长而发生丢失。与真核表达质粒相比,病毒载体介导的基因转移可以整合入宿主的基因组中,具有更好的稳定性。最初研究的鼠干细胞病毒和后来的腺病毒载体在转染分裂增殖旺盛期的细胞时都取得了较好的效果,但对于分裂增殖缓慢和处于静息期的细胞基因转染的效果却不尽人意。慢病毒载体出现以后,先后在造血干细胞,胚胎干细胞,以及在体的神经胶质细胞,神经元的基因转移中都取得了成功。随着慢病毒载体的构建更加完善和基因组学蛋白质组学的进展,基因治疗成为一些疾病的最佳选择。而慢病毒载体的一些生物学特性使许多基因治疗的设想具备了可行性。由于慢病毒家族中的HIV-1及其他类型的病毒对人类和动物有极大的危害性,因此慢病毒载体的生物安全性成为阻碍其应用的主要问题。第三代的慢病毒载体虽然已经进一步提高了载体系统的安全性,并且在以前的研究中并没有在载体生产过程中产生野生型病毒的报道。但要使慢病毒载体系统应用于临床,还需要从以下几个方面作出进一步的努力。首先在载体设计过程中应进一步缩短载体及包装质粒中的病毒编码序列,这样可以降低病毒基因重组的几率,但是载体中的包装信号和包装质粒中的gag序列之间的重复不可能完全避免,因此有必要在生产过程中通过长期培养和PCR技术对生产出来的病毒载体进行分析。另外在载体设计时应避免出现潜在的自杀基因,这类基因一旦被激活,会导致靶细胞的死亡。如果慢病毒载体真正应用于临床,那么机体的免疫系统会引发针对注入的病毒颗粒的免疫应答,这些病人就可能在HIV抗原检测中呈阳性结果,导致诊断的混淆和病人心理上的压力。因此为进一步提高慢病毒载体的生物安全性,应在临床应用前对其进行多方面的安全检测和分析。通过以上的介绍,慢病毒载体是理想的真核细胞基因转移工具,通过对其结构和功能的进一步的完善,在科学研究中有着广泛的应用前景。慢病毒载体可以转化处于分裂静止期和分化终末状态的细胞,今后应用在一些可以通过基因治疗方式治愈的疾病的实验和临床研究中。比如一些神经系统疾病。在神经系统中,绝大多数的神经元和胶质细胞处于一个相对静止的时期,其它的逆转录病毒载体对于神经系统疾病的基因治疗显得无能为力,而实验证实,慢病毒载体无论是在体外细胞及组织培养实验中,还是在在体的基因治疗实验中,对神经元和胶质细胞都具有稳定的转染能力。因此,慢病毒载体为一些神经系统疾病的基因治疗带来了希望。近期的研究表明,由慢病毒载体系统介导的应用GDNF(胶质源性神经营养因子)对帕金森氏病进行基因治疗已经在灵