微管实验protocol中文版

TUbulinPolymerizationAsssiyKit(Cytoskeleton-Cat.#BK011P)^—Control3yMV—PMlilwllime{s)nuclccticxiLLgrewth一、微管体外聚合实验^—Control3yMV—PMlilwllime{s)nuclccticxiLLgrewth分为3个时相，成核期.生长期、平台期。Paclitaxel会消除成核期并增加生长期的Vmax,而Nocodazole则导致Vmax减少和聚合虽减少。微管蛋白(tubulin)III55kDa的aB微管蛋白组成，真核中保守，故采用猪脑提収。tubulm聚合时先形成proto-filaments再形成microtubules□组分描述Bufierl(Part#BP01)2管•干粉•每管加10nxL超纯水配成l^bufier.包括组分描述Bufierl(Part#BP01)2管•干粉•每管加10nxL超纯水配成l^bufier.包括80mMPIPES.2niMMgCh.0.5mMEGIA・pH6.9・10pM荧光报告星团GTPstock(Cat.#BST06-001)3管.干粉.每管加入100j.iL灭菌水配成1OOniMstocksolutionTAulm蛋a(Cat.#T240-DX)含有10mg冻干微管蛋口.从猪脑纯化.>99%纯度.白色粉末TAulmGly:erolBufier(Cat.#BST05-001)1管.10mL,包括SOmMPIPES.2mMMgCh・0.5mMEG7A・60%甘油.pH6.9Paclitaxel(CatttTXDOl)1管.干粉.加入IOOmLDMSO配成2mM母液DMSO1管•lmL・配制Paclitaxel用Halfarea96wellplate1块.黑.平底.CoiiungCostarCat.«3686IIIsteedyQ^ti:LibriuTi二、试剂盒组成三、试剂盒重构(-80度保存6个月)1、Buffei1(Part#BP01)：每管加10ml超纯水，2管混匀，13X1.5mU管分装(2mLEP管〉2、GTPStock(Cat.#BST06-001)：每管加100山灭菌水,3管混匀■13X20^L/管分装(0.5mLEP管)Tubulin蛋白(Cat.#T24O>DX)：a、将12个标有"tubulinstock,10mg/mLM的冻存管置于冰上预冷b、20jiL(1管)100mMGTPstock冰上解冻，将15pL的100mMGTPstock与1.5mL(1管)冰预冷的Buffer1混匀，取l.lmL的Buffer1(含GTP)重悬Tubulin粉末，冰上放豐2分钟以彻底重悬c、12XS8HL分装，忙液氮中瞬间冷冻(dropfreeze)后于-SD度保存，每管可用于6-S个assay4、Paclitaxel(Cat.#TXD01)：加入100吐的DMSO5、TubulinGlyceiolBuffer(CushionBuffer)(Cat.#BST06-001)：无需重构，4度保存四、使用步骤1、仪器设世为动态读值，1分钟1读共6D分钟(有时可缩为30分钟)，激发波长360nni/发射波长450mn,当scale最大值为120时gain设为80,每孔读值3次，integration设置为(MOps,振动设为5s(Medium,orbital-firstreadonly?),板子使用ComingCostar96-wellplate(ComingCostar,Cat.#3686)。将100|iL的］0倍稀释的buffer1加入每孔中并激活NeyTenplateScanProcedurec2、将96孔板(ComingCostar.Cat#36S6)世于酶标仪中，37度预热10分钟。3、将paclitaxel母液解冻,5卩1加入32泌灭菌水，得30p.Mpaclitaxel(10X母液人使用前置室温。4、化合物配成2mM母液再水中稀释成10X母液,10mM化合物1：100至水再1：10至测活体系成10mM。5、直到化合物准备好了再开始下面的实验。6、1.5mL(1管)的Bufferl解冻后置于冰上。7、20|iL(1管)的GTPstock解冻后置于冰上。8>将TubulinGlycerolBuffer从4度収出垃于冰上。9、88nL(1管)tubulin(880^g,即10mg/mL)医篁祖水浴中迅速解冻后置于冰上|以免微管聚合。

10、速将Bufferl>TubulinGlycerolBuffer>GTPstockTubulinStock按下表制成反应液，冰上可放lh。ComponentStandardConditionsInhiiitorDetectionEnhancerDetectionFinalConcentration共444・4pl可用于8个孔Buffer1243nL205pL（丄管）7355j.iLIXTubulinGlycerolBuffer112pL150HLNoneVanesGTPstock（100mM）4.4pL4.4pL（丄管）444j.iLlmMTubulinstock（1Onig/mL）85nL85pL（1管）35pL2nig/niL11、两副孔，5吐对照buffer（与溶解化合物的buffer—致）加入A1&BL5（11的lOXpaclitaxel加入Cl&D1.5山的10X测试的化合物加入E1&F1,直到所有化合物加完。12、将加有lpl化合物的板子放于酶标仪预热1分钟（不得超过1分钟以免蒸干九13、96孔板每孔加入50g的反应液，要快口使用适当速度贴孔壁排液以避免产生气泡。14、立刻读数，如果开始后5分钟内出错可重新读数。五、注童事项注1：lOXinhibitor阳性对照：5“L的5mM氯化钙溶液或30^tMNocodazole/vinblastine（长春碱）/colchicine（秋水仙素）：10Xenhancer阳性对照：30|iMPaclitaxel,kit中初始浓度为2mMo注2：8个孔内可单道加，1分钟加完：超过8个孔需排枪加：隨中快速且贴着孔壁较低的位萱艇避免产生气泡，可用2mg/mL的BSA蛋白溶液练习注3：标准的反应体系包括2mg/mL微管，80mMPIPESpH6.9,2.0mMMgCl2>0.5mMEGTA,l.OmMGTP和15%||-；l!|o|要优化对inhibitor的检测采用20%甘油，检测enlumcer则采用15%甘油注4：儆管必须放冰上直到加入96孔板云药在加入微管前pB|96孔板。初忑返物怖匿孟栄注5：微管要在分装前在|液氮中速冻|后再世于-SO度甌保存:且冻存前微管蛋白浓度要庆于6mg/mL|°初忑返物怖匿孟栄注6：测活标准条件是|2mg/mL微管+lmMGTP+15%甘油的Buffer斗腥进解聚|采用更高浓度微管蛋白产生高信号：促进聚合|不用/用低浓度甘油有助于检测，如不加甘汕微管不会聚合而paclitaxel则会促进聚合。如果要找通过结合微管疏水口袋而促进微管解聚化合物则可不加甘油并增加微管含虽或者使用MAPs（不是通过与微管疏水口袋结合而定通过离子性结合九注7：1个单位的微管（lOOng,5兔L）加入1个孔，于30分钟后达最大荧光值（强度增3V倍）。六、Troubleshooting技术支持：tservice@cytoskeletoncom问題解决方案没有聚合1）340・360nm（激发）.410-460nm（发射）2）动态读值.30s-lnun读一次数值波动1）所有步骤严格遵守.CV值在11%2〉需要GTP的buffer冰上放置时间不超过4h•超过4h后丢笫不可垂复使用实验间的不一致的聚介结果1〉做管蛋口失活.可能由不正确冻存导致:10mg/niL浓度微管于液氮中速冻且不可冻融使用：保存时蛋口浓度要高于6mg/mL：干粉受潮所致2）聚合时严格控制在刃度.测活前96孔板