通心络对鸡胚绒尿囊膜血管生成作用的影响

通心络对鸡胚绒尿囊膜血管生成作用的影响

冠状动脉狭窄或狭窄的冠状动脉容易出血，这通常影响着心血管疾病的临床症状。近年来，冠状动脉内动脉旁路置换科（cabg）、经皮动脉内血管成形术（ptca）和心肌内激光穿孔等新技术的发展取得了一定的疗效，但一些患者的药物治疗效果不佳，不适合血管置换术。即使术后出现25%50%的再狭窄率，用血管置换术的抗心力衰竭作用也逐渐成为研究的重点。血管新生疗法是通过加强新侧血管的自然过程来维持动脉逐渐开放时的血流量。在本研究中，我们计划通过鸡囊腔毛尿囊膜模型（com）模型来探讨中医通心络对血管生成的影响。1材料和方法1.1模型准备香港麻花鸡胚蛋,蛋重50～65g,由上海沪广家禽育种有限公司提供。1.2试剂甲醇(国产分析纯),丙酮(国产分析纯),孔径0.45μm的微孔滤膜(上海华美生物工程公司)。1.3解剖显微、电子天平培养箱(日本池本理化工业株式会社),超净工作台(上海净化设备厂),解剖显微镜(日本Olympus公司320040型),电子天平(上海精密科学仪器有限公司JY2002型)。1.4特效药1.4.1通心络药粉由河北以岭药业有限公司提供,主要由人参、水蛭、全蝎等组成,以蒸馏水配制成1g/ml药液。1.4.2灌胃剂量对大剂量大剂量组的影响普通级雄性Wistar大鼠,体重(220±20)g,常规喂养。通心络小剂量及大剂量组分别按成人(50kg)公斤体重剂量的5倍、10倍量灌胃,空白组给予与大剂量通心络组相同体积的生理盐水。按文献报道的方法分别制成大、小剂量通心络及空白血清,分装后-30℃保存,经培养实验证明无微生物污染后使用。1.4.3重组革质化细胞生长因子bfgf由珠海东大生物制药有限公司生产(商品名“贝复济”),批号(98)卫药准字(珠东大)S-01号。1.5透明膜的制备参照付生法、姜志钢等报道的方法略加改进。白皮种蛋消毒后放入37℃孵化箱,气室向上,每天转动3～4次,至孵蛋第9天,消毒种蛋表面后在气室顶端打1～2mm小孔,在距胎头前1cm、2条前卵黄静脉之间的卵壳投影部位标记1.1cm×1.5cm的长方形区域,磨切透卵壳,在卵壳膜上轻轻划破直径约1mm的小孔,滴加少许无菌蒸馏水分离小孔边缘的卵壳膜,将无菌的直径为6mm的微孔滤膜载体放在CAM的血管最少处,然后在载体中央加各组相应的药液,加药液量为每蛋10μl。加药后,用无菌透明胶封窗,标记后再放入37.8℃的孵箱内孵育3d。加药3d后,每蛋注入1∶1的甲醇、丙酮等量混合固定液2.5ml,室温下固定20min,待CAM上血管内的血液凝固后,揭去封窗的透明膜,剪除CAM水平以上的蛋壳,以滤膜载体从中心把CAM剪下,放入盛有少量水并铺有滤纸的平皿里展开,阴干,连同滤纸保存。解剖显微镜下以相同放大倍数计数血管,以实验部位边缘(即微孔滤膜载体边缘)1mm范围内为一级血管,以实验部位边缘5mm处为二级血管,凡属趋向性生长的血管,即为载体从中心发出,与滤膜半径的夹角小于45度者均予计数,而穿行、绕行的血管则不算在内。一、二级血管分别观察计数。1.6统计处理所有数据以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,应用SPSS统计软件进行单因素方差分析比较各组间差异。2各组血管生成数的比较通心络对鸡胚绒毛尿囊膜一级、二级血管生成的影响见表1和图1～4(封三)。如表1所示,与空白血清组相比,贝复济组及通心络大剂量组血管生成数明显增加(P<0.05),且通心络大剂量组与贝复济组无明显差别(P>0.05),但通心络小剂量组的血管生成数则明显少于贝复济组(P<0.05),提示通心络有促进血管生成的作用且呈剂量依赖性。3讨论3.1中药复方制剂与体内实验设计的比较,有利于药物在体内进行体外实验和以推动药单味中药作为天然药物本身成分就很复杂,而中药复方则更是所组成药物的有机组合,体现的是一种综合作用,且药物进入体内后还会发生一系列的代谢变化,中药粗制剂直接加入离体反应体系中并不能显示药物在体内的代谢过程,因此中药复方药理的体外研究往往和体内实验存在一定的差距,而使中药经口服吸收后用含药血清进行体外实验,可以更真实地体现药物在体内代谢后的作用。本实验中,由于通心络粉末极难溶于水,因此我们采用血清药理学的方法既解决了水溶性的问题,又能最大程度地模拟药物经体内代谢后的作用,从而使所得结果基本与临床相一致。3.2冠血流动的生物活性物质及相关问题血管新生即原有的血管又产生新的血管,生理情况下血管生长处于相对平衡状态,当发生缺血缺氧及肿瘤等应激情况时平衡失控,血管新生的过程被激活,导致侧枝血管形成。以往对冠心病发展过程中冠状动脉侧枝循环的研究主要集中在压力梯度及血流量等物理因素,而目前研究发现在心肌缺血缺氧时,冠脉侧枝的形成可以减少或抵御心肌缺血或坏死,保证血液的正常供给,而其中成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)的信使核糖核酸(mRNA)表达明显增多,说明侧枝循环的建立可能与具有生物活性物质的作用有关,但是目前采用促血管新生因子治疗冠心病还处于临床实验阶段,还有诸如给药途径、起效时间及安全性等问题有待解决。3.3对血管的作用近年来已建立了多种实验模型以检测生物或物理机械因素对侧枝循环形成的干预作用,包括对犬、猪等大动物进行直接心脏部位的血管计数,或通过鸡胚尿囊膜、动物颊囊膜等的血管生长对反映促血管新生作用的强弱,其中鸡胚尿囊膜由于模型简便易行,计数指标客观成熟并具有良好的重复性,可定性定量地检测不同组织或细胞系分泌成分及生物因子等对血管的作用,从而广泛应用于中药的血管生成活性及作用特点的研究。3.4气养血气,阴血清气之风通心络是依据中医络病理论研制的治疗冠心病的复方制剂,由人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、赤芍等组成,以