兔主动脉粥样硬化斑块的干预作用及分子机制研究

兔主动脉粥样硬化斑块的干预作用及分子机制研究

动脉硬化和斑块不稳定型血栓形成是急性动脉综合征（acs）的主要病理基础，炎症是导致斑块不稳定型。这种机制可能与局部金属酶（pmp）的活性增加和血管壁细胞的死亡有关。另一方面,多个大规模临床研究已经显示甲基羟戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂(他汀类药物)能够降低心血管急性事件的发生率和病死率,且不依赖于其降脂作用,提示其有促进斑块稳定的作用。中药通心络用于治疗冠心病、心绞痛疗效显著,但其对粥样斑块是否具有稳定作用,尚无明确结论。本研究通过建立兔主动脉内膜损伤加高脂喂养的粥样硬化模型,对粥样硬化斑块不稳定性以及辛伐他汀和通心络的干预作用进行评价和对比。实验方法及样本1.粥样硬化模型建立与分组:29只日本大耳白兔,体重2.14kg±0.26kg。其中正常组6只给予普通饲料喂养8周,23只建立动脉粥样硬化模型(球囊损伤主动脉内膜加上1%高胆固醇饲料喂养,持续16周),再随机分成3组:通心络组(6只,1g·kg-1·d-1灌胃),辛伐他汀组(9只,2mg·kg-1·d-1灌胃)和模型对照组(8只,不给药)。2.主要试剂和药品:辛伐他汀(商品名舒降之)由杭州默沙东制药有限公司提供,通心络药粉由河北以岭医药集团提供,小鼠抗兔巨噬细胞单克隆抗体(RAM-11)购自丹麦DAKO公司,小鼠抗人MMP-1多克隆抗体(IM-35L)购自ONCOGENE公司,山羊抗小鼠COX-2多克隆抗体(SC-1746)购自SantaCruz公司,内皮素放免药盒购自解放军总医院科技开发中心放免所,一氧化氮检测试剂盒购自晶美生物工程有限公司,PCR引物由上海生工生物工程公司合成。3.血脂和内皮功能检测:分别于实验开始前(0周)、第3周末和实验结束时(16周末),经兔耳缘静脉抽血,离心分离血清,使用全自动生化仪,酶法检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。结束时(16周末)抽取静脉血4ml,根据试剂盒操作说明分别测定血清内皮素(ET)和NO水平。4.主动脉标本的病理形态学观察:于实验第16周末,麻醉后处死兔子,游离并取出主动脉全长,使用苏丹Ⅲ染液进行染色,并在主动脉下段取材,常规包埋,5μm连续切片,分别进行HE染色、弹力纤维染色及免疫组化染色。使用图像分析软件(Image-ProPlus5.1)计算斑块/内膜面积比、内膜/中膜厚度比、斑块内胶原阳性染色面积比(阳性染色面积/斑块总面积)、巨噬细胞阳性染色面积比、MMP-1阳性染色面积比及COX-2阳性染色面积比。5.主动脉血管组织蛋白定量检测:称取血管组织100mg,匀浆后提取总蛋白。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳后,使用与免疫组化相同的一抗进行免疫反应并显色,图像经扫描仪扫描,用凝胶图象处理软件(gel-pro4.0)分析目标条带的面积和灰度值。样本表达量=(目标条带的面积×灰度值)/(正常组蛋白表达面积×灰度值)。6.主动脉血管组织RNA逆转录聚合酶链反应(RT-PCR):称取血管组织约100mg,反复匀浆后使用异硫氰酸胍一步法提取总RNA。经过逆转录及扩增步骤后,在琼脂糖凝胶板上进行电泳,所得电泳条带经摄片后,使用凝胶图象处理软件(gel-pro4.0)分析目标条带的面积和灰度值,测定样本mRNA的相对表达量=(目的条带信号面积×灰度值)/(内对照信号面积×灰度值)。引物分别为:FasL:5′-GAAATGGGAAGACACATATGGAACTGC-3′,5′-CATATCTGGCCAGTAGTGCAGTAATTC-3′,Bcl-2:5′-GTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3′5′-CTTCAG-AGACAGCCAGGAG-3′。7.统计学分析:使用SPSS11.0统计软件,资料以x¯±sx¯±s表示,两组间比较用独立样本t检验,各组自身不同时点比较用配对t检验,多组间比较用方差分析和q检验。结果1.对血脂及血脂作用的影响各组血脂基础水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。实验结束时各组血脂与基础水平相比,正常组有约1~2倍的升高(P<0.05),而模型组与干预组均有显著升高(P<0.05~0.01),其中模型组TC升高约40倍(表1)。辛伐他汀组血脂比模型组降低(P<0.05~0.01),而通心络组除HDL-C外仅轻度降低并且无统计学意义(P>0.05)。通心络降脂作用不明显。模型组ET显著升高(P<0.01),而NO显著降低(P<0.01);两药物干预组ET比模型组降低(P均<0.01),NO比模型组显著升高(P<0.01~0.05);两干预组之间比较,ET和NO差异无统计学意义(P均>0.05)。2.兔主动脉斑块的形态正常组兔主动脉内膜光滑、平整,未见到脂纹和斑块。模型组兔主动脉管壁粥样斑块范围最广泛、程度最重,多数(5/8)伴有新鲜或者陈旧机化血栓;镜下可见斑块突出管腔,内膜显著增厚,内皮细胞脱落,斑块表面纤维帽薄,偶有不完整。斑块内含大量的泡沫细胞和炎症细胞,胶原含量较少,呈现不稳定斑块特点(图1~16)。两药物干预组兔主动脉管壁斑块范围小、脂纹程度轻,镜下内皮细胞虽不完整,但是斑块表面纤维帽厚,斑块内泡沫细胞和炎症细胞较少,胶原(主要是Ⅰ型胶原)含量较多,呈现比较稳定斑块的特点。提示两药均有一定程度的斑块稳定作用。3.两组患者内皮/中膜厚度比、mmp-1和cox-2表达变化的比较除斑块/内膜面积比变化不显著外,药物干预组胶原阳性染色面积比模型组均显著增加(P均<0.05),而内膜/中膜厚度比、斑块内巨噬细胞含量(RAM-11阳性染色面积比)、MMP-1和COX-2阳性染色面积比等指标均显著减少(均P<0.05),且两组间差异无统计学意义(均P>0.05,表2)。4.两组预组间比较模型组MMP-1、COX-2蛋白表达量比正常组显著增多;与模型组相比,两药干预组均显著较低(P<0.05~0.01);两组之间差异无统计学意义(P>0.05,表3)。MMP-1和COX-2在阳性染色面积比(r=0.533,P=0.007)和蛋白表达水平(r=0.833,P<0.01)之间均存在显著的线性相关。5.faol和bcl-2表达比较mRNA表达水平:模型组FasL表达比正常组显著增多,而bcl-2表达显著减少;两药物干预组FasL表达比模型组显著减低(P<0.05~0.01),而bcl-2表达显著增高(P<0.05~0.01);通心络组FasL表达显著高于辛伐他汀组(P<0.05,表3)。辛伐他汀对斑块稳定性的影响急性冠脉综合征(ACS)主要病理基础是不稳定粥样硬化斑块发生破裂,并继发急性血栓形成,而与冠脉管腔本身的狭窄程度无关,斑块自身的不稳定结构(例如大的脂质核心、薄的纤维帽)加上促发因素(包括体力活动、心理应激、寒冷、急性炎症等)是导致斑块破裂的主要原因。本研究结果显示斑块组织中MMP-1和COX-2表达均显著增加,二者存在明显的位置对应关系和显著的剂量相关性,证明斑块的不稳定性与MMP-1和COX-2表达增加有关。Bcl-2是凋亡抑制基因,Fas配体(FasL)蛋白是一种促进细胞凋亡因子。有关不稳定粥样硬化斑块中细胞凋亡的调控机制目前研究较少。本研究结果显示,不稳定斑块中FasL表达显著增强而Bcl-2表达减低,提示细胞凋亡增加也是造成斑块不稳定重要原因之一。多项大型临床研究均证实他汀类药物可显著降低患者的主要冠脉事件发生率和死亡率。本研究结果显示,辛伐他汀能使经过高脂喂养的兔血管内皮功能改善、内膜增生减轻、斑块表面纤维帽增厚、斑块内泡沫细胞和巨噬细胞减少、平滑肌细胞和胶原含量增加,提示辛伐他汀有明确的促进斑块稳定的作用。本研究未能观察到辛伐他汀干预使斑块面积减小,可能与药物剂量或者动物种类有关,但是并不影响最终的结论,因为主要是斑块结构而非数量决定斑块稳定性。有研究表明巨噬细胞合成MMP依赖于前列腺素E2(PGE2)/环磷酸腺苷(cAMP)途径,且PGE2的合成又受到环氧化酶(COX)和前列腺素合成酶活性的共同影响,因此COX酶活性最终能够影响MMP的表达。本研究已经发现在不稳定斑块中COX-2、MMP-1表达明显增强。而辛伐他汀组斑块内MMP-1、COX-2表达明显减少,提示辛伐他汀促进斑块稳定的作用与抑制MMP-1、COX-2表达有关,辛伐他汀不仅抑制MMP活性,更能直接抑制COX-2的活性,从而进一步减少了MMP的表达。因此对于COX-2的抑制也是他汀类药物促进斑块稳定的重要机制之一。抑制COX-2不仅能够减少下游炎症因子(包括前列腺素、花生四烯酸、IL-8、MMP-3、MMP-1等)的形成,还能减少局部SMC和巨噬细胞内脂质聚集,减少由此来源的泡沫细胞数量,减少新生血管形成,可能避免斑块快速进展,另外COX产物对平滑肌细胞具有抗增殖和抗迁移作用,抑制COX-2能够使斑块更加稳定。本研究显示辛伐他汀也能使斑块中促细胞凋亡基因FasL表达下降,而抑制细胞凋亡基因Bcl-2表达增强,这提示辛伐他汀促进斑块稳定与调节细胞凋亡基因的表达,减少斑块内细胞凋亡有关。有研究表明通心络可以改善冠心病患者的血管内皮功能,抑制血小板凝集反应,减少动脉粥样斑块黏附因子的表达,降低血清oxLD