第三章高效液相色谱分析

第三章高效液相色谱分析第1页，课件共57页，创作于2023年2月3.1高效液相色谱分析法的特点1.高压采用高压泵使流动液能迅速通过色谱柱，一般达150×105～350×105Pa。2.高速高压带来高速，分析时间一般少于lh。3.高效柱效能约可达3万塔板/米（GC的柱效约为2000/米）。4.高灵敏度由于采用了高灵敏度的检测器，最小检测量可达10-9g，甚至10-11g。5.可用于高沸点的、不能气化的、热不稳定的以及具有生理活性物质的分析

一、高效液相色谱法第2页，课件共57页，创作于2023年2月二、HPLC与GC差别

1．分析对象的区别

GC：

适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测。(占有机物的20%)

HPLC：

适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物的80%）第3页，课件共57页，创作于2023年2月2．流动相的区别GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。3．操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）第4页，课件共57页，创作于2023年2月三、HPLC的应用

applicationofHPLC1.环境中有机氯农药残留量分析

固定相：薄壳型硅胶(37～50m)

流动相：正己烷流速：1.5mL/min

色谱柱：50cm2.5mm(内径)

检测器：差示折光检测器

可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。第5页，课件共57页，创作于2023年2月2.稠环芳烃的分析

稠环芳烃多为致癌物质。

固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱温：50ºC

柱压：70104Pa

检测器：紫外检测器第6页，课件共57页，创作于2023年2月第二节影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。

在高效液相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两项，即：

H=A+Cu

故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示：第7页，课件共57页，创作于2023年2月第8页，课件共57页，创作于2023年2月（1）流速：流速大于0.5cm/s时,H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。第9页，课件共57页，创作于2023年2月(2)

液体的粘度比气体大一百倍,密度为气体的一千倍,故降低传质阻力是LC中提高柱效的主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温

改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。第10页，课件共57页，创作于2023年2月1．分离原理：利用组分分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异

分离前提：K不等或k不等一、液固吸附色谱法（LSC）

流动相为液体，固定相为固体吸附剂第三节HPLC分离类型与原理第11页，课件共57页，创作于2023年2月2．固定相<>分为极性和非极性两类<>极性固定相：硅胶、氧化铝和氧化镁、硅酸镁分子筛等，其中极性硅胶应用最普遍。<>非极性固定相：多孔微粒活性碳、多孔石墨化炭黑，以及高分子多孔微球等。第12页，课件共57页，创作于2023年2月1）硅胶：

<>无定型硅胶最早使用，传质慢、柱效低<>薄壳型硅胶直径为30~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm

厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质快，但柱容量有限。<>全多孔球型硅胶粒度一般为5~10μm，颗粒和孔径的均一性都比前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相的主体，也是键合固定相的主要基质。原理-吸附特点-峰易拖尾适用-分离极性化合物第13页，课件共57页，创作于2023年2月2）高分子多孔小球：特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物第14页，课件共57页，创作于2023年2月3．流动相

除了最基本的要求之外，主要考虑溶剂强度，溶解度参数及极性参数等。第15页，课件共57页，创作于2023年2月1．分离原理：利用组分在两相中溶解度的差异2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点是固定液层的耐溶剂冲刷性能差，固定液易流失，从而导致柱效降低，被键合相填料所取代。3．正相色谱-固定液极性>流动相极性（NLLC）

极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱，适于分离极性组分。

反相色谱-固定液极性<流动相极性（RLLC）

极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分。二、液液分配色谱法（LLC）第16页，课件共57页，创作于2023年2月

键合相色谱基本上属于分配色谱，与液液分配色谱固定相不同的是“固定液”以化学键的形式与载体结合在一起的。

常规化学键合相利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面

1．分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）

2．特点：不易流失热稳定性好化学性能好载样量大适于梯度洗脱4.化学键合相色谱（CPC）第17页，课件共57页，创作于2023年2月三、离子色谱法（IC）1.离子交换色谱

凡在溶液中能够电离的物质，通常都可以用离子交换色谱法进行分离，其主要根据固定相对待测离子对的亲和力的差异来实现分离。固定相类型：强阳离子交换剂（如磺酸基）强阴离子交换剂（如季胺基）弱阳离子交换剂（如羧基）弱阴离子交换剂（如氨基）流动相以水相缓冲液为主，有时加少量有机改性剂。第18页，课件共57页，创作于2023年2月

离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。2.离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。第19页，课件共57页，创作于2023年2月3.离子对色谱离子对色谱是一种分离离子型化合物的特殊分离模式。采用非极性固定相分离弱酸或弱碱等可离子化的物质时，因其在固定相上的保留作用很弱，不易分离。故在流动相中加一种与被分析物极性相反的离子（离子对试剂），使其与被分析物形成缔合物，从而增加保留，提高分离度。第20页，课件共57页，创作于2023年2月四、排阻色谱色谱size-exclusionchromatography固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离第21页，课件共57页，创作于2023年2月五、亲和色谱(AC)Affinitychromatograph原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。

先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。第22页，课件共57页，创作于2023年2月六、分离类型选择

choiceofseparationtypes第23页，课件共57页，创作于2023年2月第四节高效液相色谱仪器第24页，课件共57页，创作于2023年2月一、流程（processofHPLC）首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。

第25页，课件共57页，创作于2023年2月第26页，课件共57页，创作于2023年2月二、主要部件（mainassemblyofHPLC）

4（6）个主要部分：高压输液系统；

脱气装置；梯度洗脱；进样系统；分离系统；检测系统；

此外还配有自动进样及数据处理等辅助装置。第27页，课件共57页，创作于2023年2月第28页，课件共57页，创作于2023年2月仪器组成高压输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统第29页，课件共57页，创作于2023年2月溶剂贮液瓶用途：贮存流动相溶剂材料：玻璃或塑料，无色或棕色，容积：约为0.5～2.0L位置：高于泵，以保一定的输液静压差。1.高压输液系统第30页，课件共57页，创作于2023年2月高压输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。输液泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。第31页，课件共57页，创作于2023年2月输液泵应具备的性能①流量稳定。对定性定量的准确性至关重要。②流量范围宽，分析型应在0.1~10ml/min范围内连续可调，制备型能达到100ml/min。③输出压力高，一般可高达400~500kg/cm2。④液缸容积小，适于梯度洗脱。⑤密封性好，耐腐蚀。第32页，课件共57页，创作于2023年2月输液泵类型1螺旋注射泵2往复柱塞泵3往复隔膜泵4气动放大泵目前应用最多的是柱塞往复泵。第33页，课件共57页，创作于2023年2月泵的使用与维护防止任何固体微粒进入泵体，因此应过滤流动相。流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应停泵过夜或保留在泵内更长时间。必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于保存色谱柱和有利于泵维护的溶剂。防止流动相耗尽空泵运转，导致柱塞磨损、缸体或密封损坏，最终产生漏液。输液泵的工作压力不能超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液(40MPa,400bar,5800psi)。流动相应脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。第34页，课件共57页，创作于2023年2月2.脱气装置流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱,排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。第35页，课件共57页，创作于2023年2月目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是：①离线超声波振荡脱气；②在线惰性气体（氦气）鼓泡吹扫脱气；③在线真空脱气。真空脱气装置：将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、单流路真空脱气装置的原理二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。一般真空脱气装置有多条流路，可同时对多个溶液进行脱气。第36页，课件共57页，创作于2023年2月第37页，课件共57页，创作于2023年2月3.梯度洗脱装置在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。

HPLC的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。

①线性梯度;②阶梯梯度高压梯度低压梯度第38页，课件共57页，创作于2023年2月高压梯度装置结构优点：只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。缺点：使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操作。第39页，课件共57页，创作于2023年2月四元低压梯度系统结构只需一个高压泵，混合就在泵前安装了一个比例阀中完成。因比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下混合易形成气泡，常配置在线脱气装置，来自于四种溶液瓶的四根输液管分别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后进入比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。第40页，课件共57页，创作于2023年2月梯度淋洗装置外梯度:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:

一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。第41页，课件共57页，创作于2023年2月4.进样系统作用：将试样引入色谱柱位置：在高压泵和色谱柱之间类型：手动或自动进样器：六通阀第42页，课件共57页，创作于2023年2月进样器

手动经注射器进样自动六通阀圆盘式自动进样器链式自动进样器第43页，课件共57页，创作于2023年2月第44页，课件共57页，创作于2023年2月六通阀手动进样器原理示意图LoadInject第45页，课件共57页，创作于2023年2月手动进样器用微量注射器将样品溶液注入六通阀注意必须使用HPLC专用平头微量注射器，不能使用气相色谱尖头微量注射器，否则会损坏六通阀。进样方式：有部分装液法和完全装液法第46页，课件共57页，创作于2023年2月第47页，课件共57页，创作于2023年2月自动进样器由计算机自动控制进样六通阀、计量泵和进样针的位置，按预先编制的进样操作程序工作，自动完成定量取样、洗针、进样、复位等过程。第48页，课件共57页，创作于2023年2月5.分离系统——色谱柱

色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm以上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。第49页，课件共57页，创作于2023年2月柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。一般柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。第50页，课件共57页，创作于2023年2月柱温箱用于使色谱柱恒温的装置，一般其控温范围高于室温，也可低于室温，通常控制柱温在30～40℃。有些柱温箱还具有柱切换装置。色谱柱的工作温度对保留时间、相对保留时间、溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。一般升高柱温，可增加组分在流动相中的溶解度，减小分配系数K，缩短分析时间；还可降低流动相的黏度，降低柱压与提高柱效。第51页，课件共57页，创作于2023年2月6．检测系统

在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。第52页，课件共57页，创作于2023年2月

1）紫外-可见吸收检测器UV-Vis：适用于吸收紫外或可见光的物质灵敏度较高，应用范围较广

(光电二极管阵列检测器DAD)2）荧光检测器FLD：只能分析具有荧光活性的物质灵敏度高，但适用范围有限

3）示差折光检测器RID：利用折光率的差别来检测，为通用型检测器，但灵敏度低，温度要求严格第53页，课件共57页，创作于2023年2月4）电化学检测器：常用的有电导检测器和安培检测器电导检测器是测量物质在流动相中电离后所引起的电导率的变化，组分浓度越高，电离产生的离子浓度越高，电导率变化就越大，多用于离子色谱。安培检测器适用于测定所有在工作电极的电压范围内发生氧化或还原反应的物质，在生化样品