白头翁汤对炎症性肠病小鼠结肠组织nlrp3、asc、caspase-1、il-1表达的影响

白头翁汤对炎症性肠病小鼠结肠组织nlrp3、asc、caspase-1、il-1表达的影响

炎症性肠病（ibd）是一种以免疫失衡为特征的肠疾病，主要包括溃疡性胃炎和克罗恩病。IBD的发病机制未明,一般认为是结肠微生物菌群的紊乱与结肠黏膜过度的免疫反应导致肠道上皮组织损伤引起的炎症性疾病。NLRP3炎症小体是一种蛋白复合体,属于核苷酸结合寡聚域样受体(nucleotide-bindingoligomerizationdomainlikereceptor,NLR)家族的成员,插头域(pyrindomain)含有3个蛋白,研究认为NLRP3炎症小体在炎症性疾病中发挥重要作用。白头翁汤出自张仲景《伤寒论》,由白头翁、黄连、黄柏和秦皮四味中药组成。方用苦寒而入血分的白头翁为君,清热解毒、凉血止痢;黄连、黄柏为臣,清热燥湿、泻火解毒;秦皮为佐,清热解毒、收涩治痢。四味合用,加强清热止痢之功,为治疗毒热血痢之名方,在古代和现代临床上的应用非常广泛,用以治疗IBD、直肠炎等均收到良好的效果。现代药理研究表明白头翁汤具有抑菌、抗炎、抗痉挛以及镇静、镇痛的作用,但其治疗炎症性疾病的分子机制未明。本实验旨在探讨白头翁汤对2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonicacid,TNBS)所致IBD模型小鼠NLRP3炎症小体的影响,探讨白头翁汤的作用机制。1材料和机器1.1实验动物清洁级BALB/c小鼠,体质量20～25g,购自中山大学动物实验中心,合格证号:0092230g,适应新环境1w后用于实验。1.2阳性对照药,以sis、秦皮、tnbs、sap为原料白头翁(RadixPulsatillae)、黄连(RhizomaCoptidis)、黄柏(CortexPhellodendriChinensis)、秦皮(CortexFraxini)均由中山大学附属第一医院药学部提供,经邝翠仪主任药师鉴定为正品;阳性对照药柳氮磺胺嘧啶肠溶片(SASP),购自上海信谊嘉华药业;zVAD-fmk、TNBS,Sigma公司;RTreagentkit、SYBRpremixExTaqⅡ,takara公司;IL-1βElisa试剂盒、IL-18Elisa试剂盒,上海丰翱生物公司;Caspase-1免疫组化试剂盒,武汉博士德生物公司。2方法2.1实验药物的制备2.1.1药渣浓缩或添加双蒸法白头翁15g、黄连6g、黄柏12g、秦皮12g,以上四味置于蒸馏烧瓶中,加8倍量双蒸水浸泡2h,加热回流1h,趁热用纱布过滤。药渣再分别加8倍量水和6倍量水加热回流1h。合并3次滤液。分别减压浓缩为195、390、780g/L(生药)制成低、中和高剂量。原液装瓶,高压消毒后密封保存。2.1.2适用于柳氮磺酰胺吡啶的稀疏剂SASP碾成粉,用双蒸水配成浓度为30g/L的混悬液。2.1.3zvad-fmk西格玛稀土生产用生理盐水将zVAD-fmk配成0.5mg/mL的稀释液。2.1.4用于制备模型试剂tnbs的溶液将5%TNBS(Sigma公司)和无水乙醇按照1∶1的比例配成2.5mgTNBS/50%乙醇溶液。2.2药动过速及给药剂量84只小鼠随机分为7组(n=12):乙醇对照组、模型组、SASP组、zVAD组及白头翁汤低、中、高剂量组。采用Morris等报道的TNBS法造模。小鼠禁食24h后,5%的水合氯醛腹腔注射轻度麻醉,外径1.8mm橡胶管(小号导尿管)插入结肠,至距肛门约3.5cm处,将TNBS溶液按100mg/kg注入结肠,注入后停留20s,缓缓拔出导尿管。夹闭肛门,置于37℃电热毯上头低位30min后放入笼中,待其自然苏醒。乙醇对照组给予100mg/kg的无水乙醇灌肠。常规饲养。造模后24h开始给药,乙醇对照组和模型组分别给予生理盐水0.5mL灌胃,同时腹腔注射0.1mL生理盐水;SASP组给予SASP混悬液0.5mL灌胃,同时腹腔注射0.1mL生理盐水;低、中、高剂量组分别给予相应浓度的白头翁汤0.5mL灌胃,同时腹腔注射0.1mL生理盐水;zVAD-fmk组给予中剂量白头翁汤0.5mL灌胃,同时腹腔注射0.1mLzVAD-fmk稀释液。给药1次/d,共7d,第8天处死动物,剖腹,摘取距肛门4cm及以上结肠4cm～5cm,沿肠系膜纵轴剖开,将结肠组织分成3段:一段用PCR样品保存液保存,用于RT-PCR的检测;一段用4%甲醛固定,用于HE染色及免疫组化检测;一段用PBS液保存,用于Elisa检测。2.3疾病症状评价用大便性状和便血程度作疾病活动指数(diseaseactivityindex,DAI)评价小鼠的疾病症状;采用涵盖结肠炎症浸润的程度、水肿、充血、坏死及炎症的深度的Wallace黏膜损害评分和结肠组织HE染色来评价小鼠结肠黏膜损害程度。2.4r-pcr检测2.4.1rna的检测从PCR样品保存液取100mg组织,TRIzol裂解待测组织,氯仿抽提,异丙醇沉淀,75%乙醇洗涤,DEPC水溶解,使用分光光度计检测在D(λ)260/280处检测总RNA浓度。2.4.2合成pta的内容严格按照takara试剂盒说明书进行逆转录。2.4.3pcr扩增严格按照takara试剂盒说明书进行PCR扩增,引物序列和反应条件见表1。2.5elisa测试称取组织质量,冰上匀浆,离心后收集上清,严格按照Elisa试剂盒进行,以空白调零,450nm波长依次检测各孔光密度D(λ)值。2.6微波修复dab组织固定,常规脱水,冰冻切片;烤片,脱蜡,水化;3%H2O2封闭,EDTA(1∶50)微波修复;PBST洗涤,画圈,滴加一抗,4℃冰箱过夜;PBST洗涤,滴加二抗,37℃孵育,DAB显色,苏木素复染;梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片;拍照;利用Image-ProPlus6.0测定积分光密度值(IOD)值。2.7统计处理各组结果用ˉx±s表示,数据分析应用SPSS13.0统计分析软件,多组分析采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。3结果3.1小鼠体质量恢复TNBS造模24h后各组小鼠开始出现体质量下降,活动度明显下降,进食减少,毛发无光泽。2d后开始出现不同程度的腹泻、便血,肛门周围出现不同程度的大便结痂,并污染肛门周围皮毛。至实验结束,与实验前体质量比较,乙醇对照组和SASP组小鼠体质量恢复并增加,其余各组小鼠体质量降低程度由高到低为:zVAD组、模型组、白头翁汤低剂量组、白头翁汤中剂量组、白头翁汤高剂量组。其中,模型组小鼠体质量低于乙醇对照组(P<0.01);SASP组及白头翁汤中、高剂量组小鼠体质量显著高于模型组(P<0.01);白头翁汤低剂量小鼠体质量低于SASP组(P<0.01);zVAD组小鼠体质量低于白头翁汤中剂量组(P<0.01),与模型组相当(P>0.05)。见表2。3.2小鼠培养条件对dai评分和黏膜镜下评分的影响TNBS造模24h后各组小鼠开始出现不同程度的软便和隐血实验阳性,3d后开始出现不同程度的血便。至实验结束,乙醇对照组DAI评分为0,其余各组DAI数值由高到低依为模型组、zVAD组、白头翁汤低剂量组、白头翁汤中剂量组、白头翁汤高剂量组、SASP组。其中模型组DAI评分高于乙醇对照组(P<0.01);SASP组及白头翁汤中、高剂量组DAI评分低于模型组(P<0.01);白头翁汤低、中剂量组DAI评分高于SASP组。见表3。小鼠Wallace评分结肠黏膜损害评分和黏膜镜下评分由高到低依次为:模型组、白头翁汤低剂量组、zVAD组、白头翁汤中剂量组、白头翁汤高剂量组、SASP组。其中模型组黏膜损害评分高于乙醇对照组(P<0.01);SASP组及白头翁汤中、高剂量组黏膜损害评分低于模型组(P<0.01);白头翁汤低剂量组黏膜损害评分高于SASP组;zVAD组黏膜损害评分高于白头翁汤中剂量组(P<0.05),与模型组相当(P>0.05)。模型黏膜镜下评分高于乙醇对照组(P<0.01);SASP组、中剂量组和高剂量组黏膜镜下评分低于模型组(P<0.01);白头翁汤低剂量组黏膜镜下评分高于SASP组;zVAD组黏膜镜下评分与白头翁汤中剂量组比较无明显差异(P>0.05)。见图1。3.3不同剂量白头翁汤组织的组织病理学检测乙醇对照组:黏膜上皮完整、充血不可见,腺体排列规则,可见少量炎性细胞浸润。模型组:黏膜上皮基本溃烂,黏膜腺体破坏严重,可见大量炎性细胞浸润。SASP组:黏膜上皮基本完整、充血不明显,腺体排列较规则,可见少量炎性细胞浸润。低剂量组:黏膜上皮缺损、充血明显,腺体排列不规则,可见较多炎性细胞浸润。白头翁汤中剂量组:黏膜上皮基本完整、充血不明显,腺体排列欠规则,可见较多炎性细胞浸润。白头翁汤高剂量组:黏膜上皮基本完整、充血不明显,腺体排列较规则,可见少量炎性细胞浸润。zVAD组:黏膜上皮缺损严重、充血明显,腺体排列不规则,可见较多炎性细胞浸润。见图2。3.4各组caspase-1、白头翁汤mrna表达量的比较NLRP3mRNA表达量由高到低依次为:白头翁汤高剂量组、白头翁汤中剂量组、白头翁汤低剂量组、模型组、zVAD组、SASP组、乙醇对照组;ASCmRNA表达量由高到低依次为:白头翁汤高剂量组、白头翁汤中剂量组、zVAD组、模型组、SASP组、白头翁汤低剂量组、乙醇对照组;Caspase-1mRNA表达量由高到低依次为:白头翁汤高剂量组、白头翁汤中剂量组、模型组、白头翁汤低剂量组、SASP组、zVAD组、乙醇对照组。其中乙醇对照组NLRP3,ASC,Caspase-1mRNA表达量低于模型组(P<0.01);SASP组NLRP3mRNA表达量低于模型组(P<0.05),Caspase-1mRNA表达量低于模型组(P<0.01);白头翁汤中剂量组和高剂量组NLRP3,ASC,Caspase-1mRNA表达量高于模型组(P<0.01);白头翁汤中剂量组和高剂量组NLRP3,ASC,Caspase-1及白头翁汤低剂量组的NLRP3的mRNA表达量高于SASP组(P<0.01);zVAD组NLRP3,ASC,Caspase-1mRNA表达量低于白头翁汤中剂量组(P<0.01)。见图3。3.5白头翁汤低剂量、模型、zvad的各组小鼠血清中随机应变量的检测实验结果显示,IL-18表达量由高到低依次为:白头翁汤高剂量组、白头翁汤中剂量组、白头翁汤低剂量组、SASP组、模型组、zVAD组、乙醇对照组;IL-1β表达量由高到低依次为:白头翁汤高剂量组、白头翁汤中剂量组、白头翁汤低剂量组、SASP组、模型组、乙醇对照组、zVAD组。其中模型组IL-18,IL-1β的表达量高于乙醇对照组(P<0.01);白头翁汤中剂量组IL-18和IL-1β的表达量高于模型组(P<0.05),白头翁汤高剂量组IL-18和IL-1β的表达量高于模型组(P<0.01);SASP组IL-1β的表达量低于模型组(P<0.01);白头翁汤低剂量组和白头翁汤中剂量组IL-1β的表达量高于SASP组(P<0.01),白头翁汤高剂量组IL-18和IL-1β的表达量高于SASP组(P<0.01);zVAD组IL-18的表达量低于中剂量组(P<0.05),IL-1β的表达量低于白头翁汤中剂量组(P<0.01)。见图4。3.6模型组与白头翁汤中的uid表达量Caspase-1蛋白在结肠上皮细胞,黏膜下层,肌层和浆膜均有表达,显棕黄色。乙醇对照组可见少量棕黄色染色,其余各组可见不同程度的大量棕黄色(图5)。Caspase-1IOD值表达量由高到低依次为:白头翁汤高剂量组、白头翁汤中剂量组、白头翁汤低剂量组、模型组、SASP组、zVAD组、乙醇对照组。其中模型组IOD值高于乙醇对照组(P<0.01);SASP组IOD值低于模型组(P<0.01),白头翁汤中剂量组IOD值高于模型组(P<0.05),白头翁汤高剂量组IOD值高于模型组(P<0.01);白头翁汤低剂量组、白头翁汤中剂量组和白头翁汤高剂量组IOD值高于SASP组(P<0.01);zVAD组IOD值低于中剂量组(P<0.05)。见图6。4白头翁汤治疗u2005的作用机制探讨IBD通常反复发作,迁延不愈,临床表现主要有腹泻、腹痛和黏液脓血便。除了治疗炎症性肠病的传统三大类药物(氨基水杨酸类药物、皮质类固醇、免疫抑制剂)外,生物制剂、微生态制剂等为炎症性肠病的临床治疗提供了更多的选择和尝试。长期以来中医药在该病的治疗上自成体系,以其疗效良好、复发率低、毒副作用小等特点逐渐在炎症性肠病的临床治疗上占据重要地位。最近研究认为,NLRP3的表达量减少与克罗恩病的发生相关。Zaki等通过对DSS诱导的NLRP3ue078,ASCue078和Caspase-1ue078小鼠结肠炎模型的研究发现NLRP3炎症小体具有抵御DSS诱导的结肠炎,维护肠道内环境稳定的作用,证实NLRP3发挥作用主要是通过在非造血肝细胞中的表达,NLRP3炎症小体激活后主要是通过增强肠道上皮细胞增生来发挥对肠道的保护作用。本实验通过白头翁汤治疗IBD模型小鼠发现,SASP和