应用pcr-dgge技术分析炎症性肠病患者肠道菌群结构

应用pcr-dgge技术分析炎症性肠病患者肠道菌群结构

炎症肠病（ibd）是一种非特异性慢性肠炎（rc），包括溃疡性胃炎（tc）和克罗恩病（cd）。近年来我国UC和CD发病率均呈上升趋势,尤其是UC病例数增加更加明显。IBD的反复发作给患者带来了极大的精神和经济负担,也极大的占用了社会医疗资源。目前IBD的病因及发病机制尚不十分清楚,近来的研究主要集中在遗传易感性、免疫异常、肠道菌群改变方面。越来越多的研究认为IBD可能主要由遗传易感体质决定,免疫调节紊乱是关键的直接发病机制,肠道菌群是这种免疫损伤过程中的重要激发因素,环境精神等因素可能是发病的诱因。可见肠道菌群在肠道免疫及IBD的发病机制中起到了关键的作用。成人肠道包含中有1000多种不同的细菌,总数在1014以上,构成了人体最大的微生物群落。传统的肠道微生物检测技术主要是从新鲜粪便中分离微生物进行表型特征测定和生化及血清学鉴定,操作费时耗力,某些特性的测定精确性差,而且不能表达分离物间的系统发育关系。近年来,基于16SrDNA的分子生物学技术促进了微生态学研究的发展,特别是被称为DNA指纹技术的变性梯度凝胶电泳法(DGGE),能有效分析复杂微生物群落及其多样性且无须培养微生物,而被越来越多地用于环境及肠道等微生态的研究。本研究以正常健康人和IBD患者粪便为研究对象,运用DGGE技术,从粪便中提取细菌总DNA,依此为模板进行PCR扩增,得到反映肠道菌群结构特征的DNA指纹图谱,并进行聚类分析及多样性分析,比较2组之间微生物种群的差异。现将结果报道如下。1临床数据1.1患者性别、年龄以2009年12月—2010年4月在本院消化内科就诊者18例为检测对象,其中9例为IBD患者(实验组),男6例,女3例,平均年龄35岁,均符合文献中IBD诊断标准。另9例为健康者(对照组),男5例,女4例,平均年龄46岁,内镜下均未见器质性病变,并排除其他疾病,在检测前均未长期服用质子泵抑制剂、激素、非甾体类消炎药。1.2样本采集所有入组者留取镜检前日粪便(10±5)g,样本采集后6h内送达实验室,密封后-20℃冷藏保存。1.3screw-capped管的制备将Zoetendal等的方法进行改进,建立“冻融+BeadBeater+试剂盒”的DNA提取方法。称取0.3g低温保鲜样品至已灭菌的含0.3g锆珠的screw-capped管中混匀,加入1mLTN150和150μL酸性酚,BeadBeater匀浆(5000r/min,3min)。冰上冷却后,采用北京百泰克生物技术有限公司生产的粪便基因组DNA快速提取试剂盒提取,按试剂盒说明书操作。1.4pcr反应体系在16SrDNA的可变序列区间设计1对细菌通用引物,用于引导16SrDNA第6—8可变区的PCR扩增反应。引物由上海生工生物有限公司合成。引物序列分别为,F968f-Gc:5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3’;R1401:5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’。反应条件:94℃预变性5min;94℃30s,56℃20s,72℃1min,共30个循环;最后56℃延伸5min。反应体系(50μL):dNtp4μL,Buffer5μL,Taq酶0.3μL,ddH2O37.7μL,上下游引物及模板各1μL。1.0%的琼脂糖凝胶电泳(0.5mL/L溴化乙锭染色)检测扩增结果,Uvl凝胶成像系统照相。目的片段理论长度约470bp。无特异扩增时,进行修复PCR扩增。1.5gaacgc-3引物序列分别为,F968f-Gc:5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3’;R1401:5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’。反应条件:94℃预变性5min;94℃30s,56℃20s,72℃1min,共30个循环;最后56℃延伸5min。体系为(50μL):其中的模板为5μL上述PCR产物,dNtp4μL,Buffer5μL,Taq酶0.3μL,ddH2O33.7μL,上下游引物及模板各1μL。1.6胺、尿素、甲酰胺和甘油的电泳参照Muyzer等方法,对细菌16SrDNA的V6—8可变区的扩增产物进行DGGE分析。DGGE用8%聚丙烯酰胺凝胶(含丙酰胺、二丙酰胺、尿素、甲酰胺和甘油),38%～58%变性梯度。电泳采用DcodeDGGE系统(Bio-Rad),电泳缓冲液为40mmol/L的Tris-乙醇(pH8.0),首先在200V电压下预电泳5～10min,随后在85V的固定电压下电泳16h。电泳结束后,进行硝酸银染色,凝胶显色定影后于UVI全自动凝胶成像系统(UVItec,USA)拍照。对于DGGE凝胶上感兴趣的条带,可以进行切胶回收并克隆测序。1.7生物多样性分析DGGE凝胶图(TIFF格式)采用QuantityOne(Bio-Rad)软件进行相似性和多样性分析。相似性分析采用聚类分析;多样性分析采用丰富度和生物多样性分析,常用Shannon-Wiener指数进行分析,丰富度(S)表示DGGE图谱每泳道的条带数;Shannon-Wiener指数(H)的计算方法为H=-∑Pilnpi,Pi为第i条带的吸光度与该泳道所有条带吸光度总和的比值。QuantityOne分析所得数据使用SPSS18.0进行Student-T检验,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1不同的肠道ge-pcr扩增效果DGGE图谱见图1,图中泳道a1～a9为健康人群粪便总菌PCR样品,A1～A9为IBD患者粪便总菌PCR样品。每一泳道代表一个样品内总菌的DGGE指纹图,不同位置的条带代表不同的优势细菌,条带亮度反映出该条带所代表细菌相对量的多少。实验中每个泳道内都有大量条带存在,但条带的数目、位置和亮度都有不同,说明每个个体粪便内细菌都有着丰富的多样性,优势菌也不尽相同。相似性聚类分析显示见图2,尽管2组间个别样本有不同程度的菌群相似度交叉,但总体仍可观察出组内各样本之间的菌群相似度较高,而组间的细菌组成结构有较大的差异,还可以观察到IBD患者样本中有箭头所示的特异性的条带缺失。2.2小鼠粪便菌群dppe条带数条带标定计数结果显示:对照组粪便菌群DGGE条带数目最多25条,最少10条,平均18条;实验组粪便菌群DGGE条带数最多20条,最少4条,平均13条。实验组的Shannon-Wiener指数较对照组明显下降,具体结果见表1。3肠道菌群与id的关系人体肠道中栖息着种类繁多和数量巨大的微生物,包括真菌、细菌和古细菌,这些微生物与人体相互依存,构成了肠道的微生态系统,对促进食物消化、产生维生素等营养物质、抵御外来致病菌侵入、刺激免疫系统等方面有着重要作用,可视作“人体第二基因组”即元基因组学(Metagenomics),是影响人体健康最重要的后天因素之一。正常情况下,这些微生物对机体无害,或有利于机体的健康。科学证据表明,环境条件的轻微变化即可导致机体微生态系统的变化,造成菌群失调,对宿主的肠道功能产生不良影响。一旦肠道菌群发生紊乱,肠道微生态破坏,就有可能会引起内源性感染。新的“慢性病的肠源性学说”认为肠道菌群可能直接参与了疾病如肥胖、糖尿病、冠心病等的发生和发展。大量研究发现肠道菌群的改变与IBD的发生、发展关系密切,Darfeuille-Michaud等检测了63例CD患者和16例非IBD对照者的回肠标本,发现21.7%的CD慢性病变可检测出致病性黏附侵袭性大肠杆菌,而对照者仅6.2%检出此细菌。GarcíaRodríguez等调查发现1a内有肠道感染者发生IBD的风险是无感染者的2.4倍。随着微生态学研究的迅猛发展,人们对肠道微生物的了解越来越深入。DGGE技术的原理是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化,从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。理论上认为,只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精细,仅有1个碱基变异的DNA片段都可被分开。该技术最先由Fischer和Lerman提出用于检测基因点的突变。自1993年Muzyer等首次将该技术应用于分子微生物学研究领域以来,已有不少应用于消化道及粪便细菌菌群的研究报道。本研究观察到,16SrDNAV6—8区的PCR-DGGE图谱能够对人体肠道主要菌群进行区分。研究中每份样本的DGGE图谱均显示高度的多态性,而且不同样本间的带型不尽相同,表明PCR-DGGE能有效地检测粪便中细菌组成的多样性,能直观地反映细菌的组成结构。DGGE图谱的聚类分析结果显示IBD患者粪便中的细菌组成结构与健康人群有较大的差异性,存在某些特异性细菌的缺失;多样性分析结果显示IB