液体菌种在发酵罐内培养效果的研究

液体菌种在发酵罐内培养效果的研究

液体药品的生产过程简单，生产周期长，菌浆质量高，接种方便，易于加工和生产，已成为发展趋势。2005年8～9月,我们引进浙江大学液体菌种生产线(5组200L液体发酵罐)进行液体菌种生产试验和试生产,取得了较好的效果。但液体菌种在制种中,由于地区条件差异,引进技术还需要加以改进,生产中出现的一些问题也需要加以注意,在此重点对污染预防和质量检查问题进行探讨。1液体菌的特征液体菌种与固体菌种相比有以下优点:1.1疫苗生产过程简单同一种培养基培养出来的液体菌种,可作为母种使用,也可作为原种、栽培种使用,减少了培养基的更换和培养环境的改变。1.2液体菌种培养周期固体菌种从母种到栽培种三级制种的时间为2个月,而液体菌种只需20天;培养固体原种或栽培种的时间需25～40天,而培养一批液体菌种只需3～7天。液体菌种大大地缩短了制种时间。1.3菌的世代相同液体菌生长旺盛,生活力强,定植快。接种后,萌发点多,发菌快,出菇周期短。1.4机械化生产线液体菌种可以用注射等多种形式接种,接种方法简便、快速、均匀,适合于机械化、自动化大规模生产使用。用液体菌种接种一般每袋成本1～3分,每人每小时可接800袋以上,提高效益4～5倍。1.5降低杂菌污染率液体菌种定量、均匀喷接于料面,菌种萌发封面好,降低了杂菌污染率。同时,菌瓶、菌袋之间菌龄均匀一致,发满瓶、袋快,出菇整齐产品质量好1.6培养基的选择以豆粕、米糠、蔗糖、马铃薯、玉米粉、麦麸、花生饼粉等原料作为液体菌种培养基,价格低廉。同时,液体菌种培养周期为1周左右,适宜于食用菌规模化、周年化、工厂化生产。2种内菌株球的重量衡量液体菌种生产效果的重要指标就是生物量,它是指每100mL液体菌种中所含的菌丝体(球)的重量(g)。要取得良好的效果,除了采用合适的培养基之外,还需要适宜的培养条件,包括:温度、压力、溶解氧、通气量、pH值、糖、氮、菌丝形态、菌丝含量、接种量、培养时间等参数。2.1不同的菌体及同一菌体在不同代谢期间的生长和产量分布它可影响发酵过程中基质的反应速率及氧的溶解度。不同的菌体及同一菌体在不同的代谢阶段其适应的温度不同,但以22℃～26℃最为适宜,在此温度范围内,菌丝体生长最快,产量最高。2.2增加溶解氧和污染增加干酵母粉的污染发酵罐内维持一定的压力可控制压力为零时的杂菌污染,并且可增加发酵液中的溶解氧。考虑到二氧化碳在水中的溶解度比氧大很多,因此罐压不宜过度,一般可控制在0.3～0.5Mpa。2.3食用菌的液体制备工艺发酵过程中的溶解氧与很多因素有关,包括通风量、搅拌程度、培养基粘度、压力等。食用菌的液体制种过程中,氧的消耗与菌体的不同生长阶段有关,一般在对数生长期为最大。提高通风量,增加搅拌程度,可提高溶解氧量,菌丝体的得率也有一定的提高。2.4培养液中的氧通气对液体培养极为重要,因为在液体培养过程中,菌丝体呼吸所需要的氧是来自培养液中的溶解氧,因此,必须不断地向培养液中提供溶解的无菌空气,并及时赶走代谢产生的废气,否则将导致培养液中的菌丝细胞很快死亡。2.5不受杂菌感染的种发酵液的pH是整个发酵过程中各种生化反应的综合指标,也是保证液体菌种不受杂菌感染的重要指标。通过对pH的监控,可以了解菌体的生长规律及代谢特征,掌握菌体的生长情况,培养出合格的液体菌种。2.6sundowner公司发酵液中的糖包括总糖和还原糖,还原糖的变化反映了菌体对碳源的利用情况,残糖的多少决定菌体培养的好坏。2.7氮传感器发酵液中氨态氮的变化显示出发酵液中氮源的变化规律,可取样液采用化学方法测定。2.8形式1通过对发酵液的镜检,观察菌丝形态的变化,从中了解菌丝的生长情况。2.9蘑菇含量可通过菌丝含量的测定,了解菌丝生长情况以及与各种参数之间的关系,为确定最佳生长条件及生产工艺提供科学的依据。2.10共享性容量接种量直接影响到菌丝的生长速度、生长质量。2.11培训时间培养时间越长,菌丝体越多,但是所需要的养分也越多,感染杂菌的机会也越多。3接种后菌袋污染原因用液体菌种生产栽培种,同固体菌种相比,除降低成本、缩短周期、提高产量外,而且降低污染率4%左右(固体菌种污染率在5%左右,而液体菌种污染率不足1%),但如不注意相关环节,也会造成接种后菌袋污染,主要原因有以下几个方面:3.1培养基的完全消毒在菌袋灭菌过程中因温度或时间处理不当,造成灭菌不够彻底,液体菌种接入后,菌丝长至1/3左右时,杂菌由料中间向外生长造成污染。3.2接种环境不合格接种环境过于粗放、接种室处理程度不够等原因导致接种环境相对较差,接种过程中杂菌及其它孢子落入菌袋、菌筐的外表面而导致染菌。3.3反应时间的染菌性使用液体菌种初期,扎袋(口)、封袋(口)技术不熟练,使培养基在空气中暴露时间过长,或接种枪频频接触菌袋、菌筐的外表面而导致染菌。3.4培养基蛋白浓度:对于原有培养营养液体菌种正常培养条件下,当达到培养终点时残糖浓度一般在0.5%以下,若配置培养基时糖浓度太大,或其它原因导致残余营养物质浓度过高,杂菌极易在这样的营养液体上萌发、繁殖,因而易导致染菌。3.5细菌的繁殖液体菌种老化甚至自溶以后再接种萌发能力大大降低或不萌发,而局部湿度又大,因而易造成染菌。3.6连接时间培养好的液体菌种应该马上用于生产,这样菌种活力强,萌发好。液体菌种保藏后使用,易造成菌种酶活性下降或菌体自溶,降低活力。3.7匀覆盖表面的接种液体菌种接种量以菌种接入瓶或袋内均匀覆盖表面为宜。通常850mL的塑料瓶接种15～18mL。接种量少,菌种局部萌发、封面,易造成污染。3.8培养料杀菌不彻底试验表明,液体菌种较固体菌种对培养料质量要求高。培养料杀菌不彻底、发酸变质、含水量不适宜等,均会导致液体菌种萌发效果不好。在生产上,往往将液体菌种萌发效果不好归结于菌种质量而忽视了料的质量。4液体药品的质量分析培养结束时,液体菌种必须经过质量检查才能使用。4.1由细菌中自然乳状液染色(1)纯度检查镜检或平板培养无细菌、霉菌析出。(2)活力检查镜检菌球边缘菌丝分支细密,用结晶液染色时着色深,菌丝细胞原生质尚未出现凝集现象和空胞,静止5min,醪泥不下沉。(3)菌球大小80%菌球直径小于lmm。(4)出菇能力香菇、平菇等菌丝镜检有锁状联合结构,醪泥静止培养有原基形成。4.2菌种的取样在液体菌种生产过程中,我们总结出一套简便、直观的检测方法:(1)菌液颜色如培养液颜色混浊,大多为细菌、放线菌、酵母菌污染,不能作为菌种使用。菌液中加入糖等营养物质,灭菌后溶液成浅茶红色,随着营养的被利用,溶液颜色也越来越淡,绝大多数呈淡黄色或橙黄色,如平菇、金针菇。也有些品种比较特殊,如香菇、猴头的培养液呈黄棕色。黑木耳的培养液呈青褐色,粘稠,有香甜味。密环菌呈浅棕色。(2)菌液气味菌种培养前期,因菌液中含有大量单、多糖类营养物质,因而糖香味很浓,随着营养的被利用,菌液的糖香味越来越淡,取而代之的是菌丝特有的芳香气味。而染菌的培养液则散发出酸、甜、霉臭、酒精等各种异味。(3)菌丝