TRIM74对流感病毒复制机制影响的研究

TRIM74对流感病毒复制机制影响的研究

叶苗苗，孙楠，李奇兵，石文军，王波，王广文，姜丽，陈化兰，李呈军（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室，黑龙江哈尔滨150069）流感病毒作为一种重要的人畜共患病毒，在感染人畜后常引起上呼吸系统疾病，具有季节性和地方性流行的特征，且存在禽流感病毒（Avianinfluen⁃zavirus，AIV）跨物种感染人的病例，因此对人畜健康和养禽业经济发展造成重大威胁。该病毒属于正粘病毒科流感病毒属，根据其核蛋白（NP）和基质蛋白（M1）抗原性的不同，分为A（甲）、B（乙）、C（丙）、D4型[1]。此外，基于病毒表面抗原HA和NA的抗原特性，可以将流感病毒分为H亚型和N亚型，迄今为止，已发现至少18个HA亚型和11个NA亚型[2]。流感病毒粒子表面有囊膜，呈多形性，含8个编码病毒蛋白的单股负链RNA片段，且每个RNA片段都能与一个核蛋白NP和一个聚合酶组成一个病毒核糖核蛋白复合体（vRNP）[3]，该结构是流感病毒基因组转录和复制的基本单位。现有的研究表明，流感病毒通过与宿主蛋白形成复杂的互作网络进而对病毒的复制产生正向或负向的选择压力，从而在病毒基因组的复制、病毒粒子的组装以及子代病毒粒子的释放等多个环节发挥重要作用。因此，深入挖掘影响流感病毒复制的宿主依赖因子（Hostdepen⁃dentfactors，HDFs）并阐明其作用机制，将有利于完善宿主与流感病毒间的互作网络，并明确宿主因子参与流感病毒复制周期的阶段，从而为流感的防控与治疗提供理论依据。三基序（Tripartitemotif，TRIM）家族蛋白泛指一类N端结构域排列高度保守的E3泛素连接酶，该类蛋白N端包含RING-B-box-coiled-coil结构域，又称RBCC结构域；C端包含高度可变的结构域，是每种TRIM蛋白的特异性标志[4]。TRIM家族蛋白存在于所有真核生物体内，且其数量与物种等级密切相关。研究表明，苍蝇基因组编码约10种TRIM蛋白，猪基因组编码约57种TRIM蛋白，而人类基因组编码超过80种TRIM蛋白，这些蛋白广泛参与细胞周期、增殖、凋亡、分化、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症反应等生命活动的调控[4-5]。近年来，TRIM家族蛋白在抗病毒和先天免疫信号调节中发挥作用的研究成为热点，已有研究发现部分TRIM家族蛋白以不同的方式调控流感病毒的复制，如TRIM22能够通过与流感病毒核蛋白NP的互作使NP发生泛素化降解从而抑制流感病毒的复制[6]；TRIM14可以有效阻断核蛋白NP从细胞质易位到细胞核，从而抑制流感病毒在宿主细胞中的传播[7]；TRIM35通过激活肿瘤坏死因子受体相关因子3（Tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor3，TRAF3）以及降解流感病毒PB2蛋白负调控流感病毒的复制[8]。TRIM74是TRIM家族蛋白中的成员，目前尚无TRIM74与病毒、TRIM74与宿主天然免疫反应相关的研究报道，其功能尚待探究。根据TRIM74C端的可变区，将其划分至TRIM家族第Ⅴ-2亚类，与TRIM74同处于该亚类的TRIM家族蛋白有TRIM31、TRIM40、TRIM56，对这几个TRIM蛋白的研究较广泛，并且它们分别靶向宿主先天性免疫反应信号通路中的不同接头分子[9-11]，其中TRIM56可以通过阻碍病毒RNA的合成进而抑制甲型和乙型流感病毒的复制[12]。TRIM74是否与处于同一亚类的上述TRIM具有相似功能尚不清楚。因此，本研究通过siRNA干扰TRIM74的表达；同时通过慢病毒包装过表达系统构建表达TRIM74的细胞系，分别利用该细胞系及转染TRIM74表达质粒上调TRIM74的表达，探究TRIM74蛋白对流感病毒复制及干扰素信号通路的影响，为进一步了解TRIM74蛋白的功能提供数据参考。1材料与方法1.1病毒、细胞及质粒AIVA/WSN/1933（H1N1）株（以下简称WSN株）、仙台病毒（SeV）、干扰素刺激反应原件（ISRE）启动子荧光素酶报告质粒pISRELuc由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室保存；IFN-β启动子荧光素酶报告质粒pIFN-β-Luc购自Addgene公司；人非小细胞肺癌细胞（A549）购自ATCC公司；人胚胎肾细胞（HEK293T）和犬肾传代细胞（MDCK）、pCDNA3.1载体、pCDNA3.1-TRIM74-V5表达质粒（简称pTRIM74-V5）、海参荧光素酶质粒pRL-TK、慢病毒过表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1（简称pLVX）以及辅助质粒pASPI2、pMDG2均由本实验室保存。1.2抗体及主要试剂poly(I:C)购自Invivogen公司，终浓度为0.5μg/mL；兔抗V5单克隆抗体（MAb）购自Millipore公司；兔抗GAPDHMAb和鼠抗TRIM74MAb购自Proteintech公司；AlexaFluorTM488兔抗小鼠IgG（H+L）（A21206）购自ThermoFisher公司；Dy⁃Light800山羊抗鼠IgG和DyLight680山羊抗兔IgG购自KPL公司；Lipofectamine2000转染试剂、RNAiMax转染试剂购自Invitrogen公司；5×SDS蛋白上样缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司；2×ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix、HiScript®RIIQRTSuperMixforqPCR（+gDNAwiper）购自Vazyme公司；Opti-MEM培养基、10×MEM培养基均购自Gibco公司；F-12K培养基购自WISENT公司；DMEM培养基购自Sigma公司；RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司；细胞活力检测试剂盒CellTiter-Glokit、双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司。1.3引物及siRNA的设计与合成根据NCBI中TRIM74基因序列（378108），设计并合成靶向TRIM74的特异性siRNA以及阴性对照NCsiRNA，序列见表1。根据NCBI中人源IFNB1基因（3456）、ISG56基因（3434）、TRIM74基因（378108）序列，利用PrimerPremier6.0软件设计合成相应的荧光定量PCR（qPCR）引物及TRIM74扩增引物（表1）。siRNA由上海吉玛基因公司设计并合成，qPCR引物及克隆引物由吉林库美生物科技有限公司合成。1.4siRNA干扰TRIM74的表达对流感病毒复制影响的检测1.4.1TRⅠM74siRNA干扰效率的qPCR检测将siTRIM74-331和阴性对照NCsiRNA各取30pmol（1.5μL），利用RNAiMAX转染试剂分别转染A549细胞，置于37℃、5%CO2培养48h后用BufferRZ裂解细胞，收获细胞样品并提取细胞总RNA，反转录为cDNA后作为模板，利用表1中的hTRIM74-qPCR引物经qPCR检测TRIM74的转录水平，以GAPDH作为内参校准，以2-ΔΔCt法分析数据结果。表1siRNA及引物序列Table1siRNAandprimerssequences1.4.2siRNA干扰TRⅠM74的表达后对细胞活力影响的检测按1.4.1中的方法将siTRIM74-331和NCsiR⁃NA分别转染A549细胞，并将细胞铺于透光的96孔细胞培养板内，置于37℃、5%CO2培养。48h后利用细胞活力检测试剂盒检测干扰TRIM74的表达对细胞活力的影响。1.4.3siRNA干扰TRⅠM74的表达后对流感病毒复制影响的噬斑滴定检测按照1.4.1中的方法将si⁃TRIM74-331和NCsiRNA分别转染A549细胞，置于37℃、5%CO2培养。48h时，将AIVWSN株以MOI0.01感染细胞，分别于感染后24h、48h收集细胞上清，采用文献中病毒噬斑滴定方法[13]，检测干扰TRIM74的表达对流感病毒复制的影响。1.5过表达TRIM74对流感病毒复制影响的检测1.5.1TRⅠM74过表达细胞系的构建与鉴定提取A549细胞总RNA并反转录为cDNA作为模板，利用表1中的TRIM74-pLVX引物对经PCR扩增TRIM74基因，并将其克隆至慢病毒过表达载体pLVX中，构建pLVX-TRIM74质粒。经测序比对鉴定正确后，将pLVX-TRIM74和辅助质粒pASPI2、pMDG2共转染HEK293T细胞包装成慢病毒，同时转染pLVX空载体和辅助质粒作为对照。48h后收集慢病毒侵染A549细胞，12h后补加含10%FBS的F-12K培养基继续培养，48h后再利用流式细胞术分选绿色荧光强度高的细胞，经过多次传代培养，获得过表达TRIM74基因的细胞系（A549-pLVX-TRIM74）以及对照细胞（A549-pLVX）[14]。分别提取上述两种细胞总RNA反转录为cDNA后作为模板，经1.4.1中的qPCR鉴定这两种细胞系；取相同数目的该两种细胞，经1×SDS蛋白上样缓冲液裂解后，分别以鼠抗TRIM74MAb（1∶1000）、兔抗GAPDHMAb（1∶1000）作为一抗，DyLight680山羊抗兔IgG（1∶10000）和DyLight800山羊抗鼠IgG（1∶10000）为二抗，经westernblot鉴定这两种细胞中TRIM74蛋白的表达。1.5.2过表达TRⅠM74对流感病毒复制影响的噬斑滴定检测将A549-pLVX-TRIM74细胞和对照A549-pLVX细胞分别铺于12孔板，待细胞密度为80%时，将WSN株以MOI0.01感染细胞，分别于感染后24h、48h收集细胞上清，按照1.4.3的方法进行噬斑滴定，检测过表达TRIM74对流感病毒复制的影响。1.6流感病毒感染对宿主细胞内源TRIM74mRNA转录水平及其蛋白表达影响的检测1.6.1流感病毒感染对内源TRⅠM74mRNA转录水平影响的qPCR检测将A549细胞和HEK293T细胞分别铺于12孔板，待细胞长满单层后，将WSN株以MOI5分别感染上述两种细胞，分别于感染后0、3h、6h和9h收获细胞样品并提取细胞总RNA，反转录为cDNA作为模板，利用表1中的hTRIM74-qP⁃CR、GAPDH-qPCR引物，经qPCR检测内源TRIM74mRNA的转录水平。1.6.2流感病毒感染对内源TRⅠM74蛋白表达影响的westernblot检测将WSN株以MOI5分别感染12孔板中长满单层的A549细胞和HEK293T细胞，设未感染病毒的细胞为阴性对照，37℃培养9h后裂解细胞，按照1.5.1中的westernblot方法检测上述两种细胞中内源TRIM74蛋白的表达水平。1.7过表达TRIM74对相应干扰素分泌水平影响的检测1.7.1过表达TRⅠM74对细胞中ⅠFN-β和ⅠSRE启动子活性影响的双荧光素酶试验将pTRIM74-V5表达质粒以不同剂量（0、50ng、100ng、200ng）分别转染HEK293T细胞，24h后裂解细胞，取裂解液经SDS电泳后，分别以兔抗V5MAb（1∶1000）、兔抗GAPDHMAb（1∶1000）为一抗，以DyLight680山羊抗兔IgG（1∶10000）为二抗，经westernblot检测TRIM74的过表达。在确定TRIM74呈剂量依赖性过表达后，将本实验分为两组：将上述不同剂量的pTRIM74-V5表达质粒及pCDNA3.1空载体（阴性对照）分别与pRL-TK、pIFN-β-Luc报告质粒共转染HEK293T细胞（1组）；另一组将上述不同剂量的pTRIM74-V5表达质粒及pCDNA3.1空载体（阴性对照）分别与pRL-TK、pISRE-Luc报告质粒共转染HEK293T细胞（2组）。37℃培养24h后分别以SeV（MOI1）感染上述各组细胞，感染12h后裂解细胞，10000r/min，室温离心10min后，取20μL上清加入96孔板，利用GloMax96MicroplateLuminometer生物化学发光仪检测各组细胞的双荧光素酶活性，分析过表达TRIM74对IFN-β和ISRE启动子活性的影响。所有实验组至少重复检测3次。1.7.2过表达TRⅠM74对ⅠFN-β和ⅠSG56mRNA转录水平影响的qPCR检测将pTRIM74-V5表达质粒转染HEK293T细胞，同时以转染pCDNA3.1空载体的细胞作为阴性对照，24h后分别采用SeV和poly(I:C)刺激细胞，并分别设未经SeV和poly(I:C)刺激的上述各组细胞作为Mock组。12h后收获细胞提取细胞总RNA，反转录为cDNA作为模板，采用表1中的引物hIFNB1-qPCR、hISG56-qPCR和GAPDH-qPCR，经qPCR分别检测各组细胞中IFN-β和ISG56的转录水平。1.8干扰TRIM74表达对相应干扰素分泌水平影响的qPCR检测分别将siTRIM74-331和阴性对照NCsiRNA转染HEK293T细胞，24h后，分别将pRLTK+pIFN-β-Luc报告质粒和pRL-TK+pISRE-Luc报告质粒转染上述各组细胞，24h后分别采用SeV和poly(I:C)刺激细胞，并分别设未经SeV和poly(I:C)刺激的上述各组细胞作为Mock组。12h后，采用1.7.2中的qPCR方法分别检测上述细胞中IFN-β和ISG56mRNA的转录水平。1.9数据的统计与分析所有数据均采用GraphPadPrism8.0软件进行统计学分析，以t检验比较各组间的差异。ns表示P＞0.05，差异不显著；*表示P＜0.05，差异显著；**表示P＜0.01、***表示P＜0.001、****表示P＜0.0001，差异均极显著。2结果2.1siRNA干扰TRIM74的表达对流感病毒复制影响的检测结果将siTRIM74-331与对照NCsiRNA分别转染A549细胞后，经qPCR检测siTRIM74-331的干扰效率，并利用细胞活力检测试剂盒检测干扰TRIM74的表达对细胞活力的影响。结果显示，与转染对照NCsiRNA的细胞相比，转染siTRIM74-331的A549细胞中TRIM74mRNA的转录水平下降了62.70%（P＜0.0001）（图1A），但不影响细胞活力（P＞0.05）（图1B），表明siTRIM74-331干扰效果较好，可以用于后续试验。将siTRIM74-331与对照NCsiRNA分别转染A549细胞，48h后用WSN（MOI0.01）感染细胞，分别于感染后24h和48h收获上清进行噬斑滴定，结果显示，与转染NCsiRNA的对照组相比，干扰TRIM74的表达再感染WSN株24h、48h后细胞中的病毒滴度分别下降5.21%和61.19%（P＜0.001）（图1C），表明下调TRIM74的表达可以抑制流感病毒的复制。图1siRNA干扰TRIM74的表达对流感病毒复制影响的检测结果Fig.1TheresultsoftheeffectofsiRNAinterferencewiththeexpressionofTRIM74oninfluenzavirusreplication2.2过表达TRIM74对流感病毒复制影响的检测结果构建的重组质粒pLVX-TRIM74经测序鉴定正确后与辅助质粒共转染HEK293T细胞包装成慢病毒，48h后收获慢病毒侵染A549细胞，48h后利用流式细胞术分选阳性细胞，多次传代后，通过qPCR和westernblot鉴定获得的细胞。结果显示，该细胞中TRIM74基因的转录水平及其蛋白的表达水平较转染空载体及相应辅助质粒获得的对照细胞均明显升高（图2A、图2B），表明TRIM74基因过表达细胞A549-pLVX-TRIM74以及对照细胞A549-pLVX均正确构建。将WSN（MOI0.01）分别感染这两种细胞，感染后24h、48h分别收集上清经病毒的噬斑滴定。结果显示，A549-pLVX-TRIM74细胞中的病毒滴度分别为9.13×105pfu/mL与2.03×106pfu/mL，对照细胞相应时间的病毒滴度分别为4.73×105pfu/mL与1.07×106pfu/mL，前者相较后者分别上升了1.93倍（P＜0.01）和1.90倍（P＜0.05）（图2C），表明过表达TRIM74蛋白可以促进流感病毒的复制。图2过表达TRIM74对流感病毒复制影响的检测结果Fig.2TheresultsoftheeffectoninfluenzavirusreplicationbyoverexpressionofTRIM742.3流感病毒感染对细胞中内源TRIM74mRNA的转录水平及其蛋白表达影响的检测结果将WSN株（MOI5）分别感染A549细胞和HEK293T细胞后，分别利用qPCR（感染后不同时间）和westernblot（感染后9h）检测内源TRIM74mRNA的转录水平及其蛋白的表达水平。结果显示，与未感染的对照细胞相比，流感病毒感染后的A549细胞和HEK293T细胞中TRIM74mRNA的转录水平随感染时间的延长而增加（P＜0.001、P＜0.01）（图3A、图3C）；其蛋白表达水平也均明显增加（图3B、图3D），表明流感病毒感染会刺激细胞中内源TRIM74蛋白的表达，推测细胞可能通过上调TRIM74蛋白的表达以某种方式响应流感病毒的感染。图3流感病毒感染对细胞中内源TRIM74的转录水平及其蛋白表达影响的检测结果Fig.3DetectionresultsoftheeffectofinfluenzavirusinfectiononthetranscriptionlevelofendogenousTRIM74anditsproteinexpressionincells2.4过表达TRIM74对干扰素分泌水平影响的检测结果2.4.1过表达TRⅠM74对细胞中ⅠFN-β和ⅠSRE启动子活性影响的双荧光素酶试验结果将不同剂量的pTRIM74-V5转染HEK293T细胞，24h后，经westernblot检测TRIM74的过表达。结果显示，TRIM74在细胞中的表达量呈剂量依赖性的增加（图4A）。将上述剂量的pTRIM74-V5与pRL-TK、pIFN-β-Luc共转染HEK293T细胞（1组）；同时将上述剂量的pTRIM74-V5与pRL-TK、pISRE-Luc共转染HEK293T细胞（2组）。24h后用SeV（MOI1）感染上述细胞，12h后采用双荧光素酶试剂盒检测双荧光素酶活性，分析过表达TRIM74对IFN-β和ISRE启动子活性的影响。结果显示，转染空载体的对照细胞在感染SeV后IFNβ和ISRE启动子被显著激活，而1组和2组细胞中IFN-β和ISRE启动子的活性均显著下降（P＜0.0001、P＜0.0001），且随pTRIM74-V5转染量的升高二者的活性均呈下降趋势（图4B、图4C）。表明过表达TRIM74能够抑制SeV诱导的IFN-β和ISRE启动子的激活作用。图4过表达TRIM74对IFN-β和ISRE启动子活性影响的双荧光素酶试验结果Fig.4TheresultsoftheeffectonIFN-βandISREpromoteractivitiesdetectedbydual-luciferaseassayinover-expressingTRIM74cells2.4.2过表达TRⅠM74对ⅠFN-β和ⅠSG56转录水平影响的qPCR检测结果将pTRIM74-V5转染HEK293T细胞，24h后分别采用SeV和poly(I:C)刺激细胞，12h后采用qPCR分别检测各组细胞中IFN-β和ISG56mRNA的转录水平。结果显示，SeV和poly(I:C)刺激后的各组细胞中IFN-βmRNA的转录水平均显著高于Mock组细胞，且转染pTRIM74-V5细胞中IFN-β的转录水平均极显著低于转染空载体的阴性对照细胞（P＜0.01、P＜0.001）（图5A、图5B）；各组细胞中ISG56mRNA的转录水平与上述结果均一致（P＜0.0001、P＜0.01）（图5C、图5D）。上述结果表明，过表达TRIM74能够抑制相应干扰素基因的转录水平。图5过表达TRIM74对IFN-β和ISG56转录水平影响的qPCR检测结果Fig.5qPCRdetectionsoftheeffectonIFN-βandISG56transcriptionlevelbyover-expressingTRIM742.5干扰TRIM74的表达对IFN-β和ISG56转录水平影响的qPCR检测结果将siTRIM74-331与对照NCsiRNA分别转染HEK293T细胞，48h后分别采用SeV和poly(I:C)刺激细胞，12h后经qPCR检测IFN-β和ISG56mRNA的转录水平。结果显示，与Mock组细胞相比，SeV和poly(I:C)刺激后的各组细胞中IFN-β和ISG56的mRNA水平均显著升高，且转染siTRIM74-331细胞中IFN-β的转录水平均显著高于转染空载体的阴性对照细胞（P＜0.0001、P＜0.0001）（图6A、图6B）；各组细胞中ISG56mRNA的转录水平与上述结果均一致（P＜0.05、P＜0.0001）（图6C、图6D），表明下调表达TRIM74显著促进相应干扰素基因的转录水平。结合2.4的结果表明，TRIM74能够负调控细胞中相应干扰素的分泌水平。图6siRNA干扰TRIM74的表达对IFN-β和ISG56转录水平影响的qPCR检测结果Fig.6qPCRdetectionsoftheeffectonIFN-βandISG56transcriptionlevelbysilencingtheexpressionofTRIM74withsiRNA3讨论流感的控制策略依赖于疫苗接种，但流感病毒亚型众多、变异迅速，需要及时更新疫苗种毒[15]，且目前的抗病毒药物如金刚烷胺等也正在失去效力[16]。因此，迫切需要探究AIV新的抗病毒机制，并基于这些机制开发新的治疗药物。根据流感病毒复制所需的宿主依赖因子（HDF）的特性设计药物或小分子抑制剂干预HDF的促病毒复制功能，可有效对抗流感病毒并最大限度地减少耐药病毒株的出现。TRIM家族蛋白含有保守的RING-B-box-coiledcoil结构域，并广泛参与细胞的生物学过程，且部分TRIM能够调节宿主细胞的先天免疫反应，并参与其对病原的识别及免疫信号传导过程[17]。目前关于TRIM74蛋白尚无相关研究报道，其蛋白功能有待探究。因此，本研究对TRIM74是否参与宿主的抗流感病毒感染及其天然免疫调节进行了初步探究。本研究采用噬斑滴定试验证明siRNA干扰TRIM74的表达后能够抑制流感病毒的复制。由于重组质粒在流感病毒靶细胞A549中的转染效率低，所以本研究构建了TRIM74蛋白的过表达细胞A549-pLVX-TRIM74和对照细胞A549-pLVX，并进