分子生物学第十三章基因诊断

第十三章基因诊断和基因治疗基因诊断基因蛋白质性状生化诊断基因诊断临床诊断传统的诊断程序

先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的生理学特性

确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌，还是其他物质

实践证明:比较有效,检测到病原微生物相对比较特异

诊断成本高、速度慢、效率低

如砂眼衣原体、朊病毒方法优点缺点显微镜镜检简单易行，可直接观察到寄生虫的形态速度慢，灵敏度低，对经验水平要求高费时费工，无法辨别形态相近的寄生虫体外培养、接种能检测到活的寄生虫，并可检测感染性和感染程度速度慢、花费高，寄生虫可能难以进行体外培养，且必须使用动物材料抗体检测简单、快速、能够实现自动化，可用于检测大量的样品无法区分活的寄生虫与处在潜伏状态的寄生虫。有时会有非特异反应发生DNA杂交及PCR快速灵敏，能够实现自动化，可以分辨不同种的寄生虫，不需要以前有寄生虫感染病史花费高，步骤多，无法区分活的和死的寄生虫，有时会有假阳性或假阴性检测寄生虫感染的诊断方法的比较现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分子生物学的方法对病原物质进行诊断检测一种有效的诊断方法应具备：

1、专一性（specificity）强，诊断只对某一种病原菌分子产生阳性反应2、灵敏度(sensitivity)高3、操作简单(simplicity)基因诊断的特点特异性高

检测目标是基因，为原始的致病因素灵敏度高

待测标本往往微量，目的基因只需pg水平稳定性高

基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需处于活性状态诊断范围广，适应性强

确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态临床应用前景好基因诊断优点从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制显著提早产前诊断的时间无需对组织、器官或细胞进行选择快捷准确、安全DNASouthern

blot,

FISH,PCR,

Sequencing,micoarray,

restriction

analysis,

RFLP，SSCPRNANorthern

blot,

RT-PCR,

micoarraysProteinWestern

blot,

Immuno-histochemistry,microarray遗传性疾病的基因诊断所有遗传性疾病都与某种或多种基因的突变有关，对这类疾病进行分子诊断有两种策略可供选择：直接诊断策略；间接诊断策略；一、直接诊断策略和方法遗传性疾病分子诊断的直接策略就是通过各种分子生物学技术直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变，如基因的缺失、插入、倍增或者是点突变等遗传缺陷。因此直接诊断的前提是被测基因已经克隆，其核酸序列和结构已被阐明。直接诊断策略主要涉及以下几个方面。全国高等医药院校教材-分子诊断学（一）点突变的诊断点突变即DNA分子中的一个碱基被另一个碱基所替换，其后果取决于替换的性质和位置。对基因背景清楚或部分清楚的点突变，可以采取直接检测基因点突变的方法如等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASO）、等位基因特异性扩增（ASA）、PCR－RFLP、连接酶链反应(LCR)、基因芯片技术进行诊断；对于一些基因背景未知的点突变，可以采用单链构象多态性（PCR-SSCP）、变性梯度凝胶电泳（DEEG）、异源双链分析（HA）、DNA序列测定、蛋白截短测试等方法。（二）片段性突变的检测

片段性突变是指DNA分子中较大范围的碱基发生突变，如碱基的缺失、插入、扩增和重组。

对于少数核苷酸缺失或插入，可以采用检测点突变的方法；

而对于大的片段突变，则使用Southern印迹技术和多重PCR技术。二、间接诊断策略和方法目前大多数遗传性疾病的致病基因尚未被定位和阐明，因此无法进行直接诊断，还有一些基因长度数百到数千碱基，突变种类多且分布广泛，这种情况下突变检测便十分复杂和困难，此时要用间接诊断策略进行诊断采用多态性连锁分析的方法，寻找具有基因缺陷的染色体、相关基因的等位基因型和单倍体型等，并判定被检者是否有这条存在基因缺陷的染色体、相关基因的等位基因型和单倍体型等。全国高等医药院校教材-分子诊断学

多态性在人群中出现的频率应大于1%（如小于1%

常认为是异常突变）。在生物进化过程中形成的，它本身并不致病或于遗传病有直接联系，故称为“中性突

变”。人类的23对染色体中，每一条上都带有许多遗传多态性位点，其中一些位点在染色体上的位置与致病基因靠的很近，甚至连锁在一起遗传，并且呈孟德尔式遗传。因此，可利用这一多态性位点作为遗传指示标记。全国高等医药院校教材-分子诊断学间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标志三代遗传标志：RFLP STR(short

tandem

repeats),VNTR(variable

number

of

tandem

repeats)SNP(single

nucleotide

polymorphism)三代分子标记进行家系、群体等连锁分析，找出致病基因。基因芯片、快速测序等高通量分析手段。第二节

遗传病的分子诊断一、血红蛋白病

hemoglobinopathy血红蛋白由两条α珠蛋白肽链和两条其他珠蛋白肽链组成的四聚体。血红蛋白病可以分为二类：①由于珠蛋白一级结构的变化所导致的异常血红蛋白病；②由于珠蛋白多肽链的合成速率不平衡所导致的地中海贫血。全国高等医药院校教材-分子诊断学六种正常血红蛋白的肽链组成和正常人血中的浓度血红蛋白种类肽链组成

(分子式)正常成人血中的浓度（%）HbA(A1)α2β295～98HbA2α2δ22～3HbFGower1Gower2Portlandα2γ2ζ2ε2α2ε2ζ2γ2～1(胎儿期)无（胎儿期早期）无（胎儿期早期）无（胎儿期早期）血红蛋白HbA基因（一）α珠蛋白基因16p13.3全国高等医药院校教材-分子诊断学（二）β珠蛋白基因11p15.5不同阶段的血红蛋白基因表达和血红蛋白组成（二）镰状细胞贫血镰刀型贫血症是一种遗传性贫血症，属隐性遗传性疾病。患者的红细胞缺氧时变成镰刀形，失去输氧的功能，破裂造成严重贫血。该病常见于非洲和美洲黑人，因为杂合基因型细胞贫血症状轻微，但红血球内的轻微缺氧对寄生在红血球里的疟原虫却是致死的，有利于防止疟疾的流行。1.镰状细胞贫血的分子机理由于β珠蛋白基因中第6个密码子的序列由原来的GAG改变成GTG，导致β珠蛋白肽链的第6位氨基酸残基由原来的谷氨酸改变成缬氨酸，改变后的血红蛋白称谓镰状血红蛋白（HbS）。该血红蛋白四聚体在脱氧时，聚集成阵列，几乎变为结晶体，使红细胞发生镰变（sickling）,弹性几乎丧失，无法通过直径比红细胞小的毛细血管。基因序列密码子

5

6

7…CCTGAGGAG……CCTGTGGAG……CCTAAGGAG…对应氨基酸…Pro

Glu

Glu…βAβSβCβAβSβC…Pro

Val…Pro

LysGlu…Glu…密码子

5

6

7…

CCT

·

GAG

·

GAG……

CCT

·

GTG

·

GAG……

CCT

·

AAG

·

GAG……

CCT

·

NAG

·

G

…βAβSβC正常镰状突变限制性内切酶识别序列2.镰状细胞贫血的分子诊断方法限制性内切酶MstⅡ识别序列为CCTNAGG，N为任意核苷酸。因此β珠蛋白基因的第5、6、7密码子中有该内切酶的识别位点。发生镰状突变后该酶切位点消失。RFLP

/

MstII

test

for

Sickle-Cell

Anemia（二）地中海贫血地中海贫血（thalassemia）是由于珠蛋白链的合成不平衡所造成的一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病。血红蛋白α地中海贫血1.α地中海贫血遗传特征（1）由于基因缺失导致的α地中海贫血基因型表

型 基因型正常人

αα/ααα地中海贫血Ⅱ（静止型）α地中海贫血Ⅰ（标准型）Hb

H病（β4）Hb

Bart’s（胎儿水肿综合症，γ4）α

-/αα-

-/ααα-

/

-

--

-/

-

-（2）由于以下基因突变导致α地中海贫血①点突变②移码突变③无义突变④mRNA加尾信号突变⑤终止密码子突变2.分子诊断方法（1）PCR法扩增产物194bp：Bart’s水肿胎儿；扩增产物194bp和287bp：HbH病或α地中海贫血

Ⅰ；扩增产物287bp：正常人或α地中海贫血Ⅱ。（2）Southern印迹法α地中海贫血的基因簇限制性酶切片段长度α基因探针ζ基因探针Bam

HⅠ

Eco

RⅠHind

Ⅲ

EcoRⅠaa/aa14

2316.5，13

23，5--/---

-20，13

17，5-a3.7/aa10.3

19.3ND

ND-a4.2/aa9.8

18.8ND

NDβ地中海贫血

1.遗传特征：突变是β地中海贫血的主要发病原因。如果突变发生在β基因的启动子区域则转录的β链mRNA水平下降；如果突变发生在剪接信号附近则导致异常的剪接；如果在结构基因中发生突变，导致β珠蛋白链的合成量减少、根本没有或产生异常的β珠蛋白链。 重型β珠蛋白生成障碍性贫血，又称为β0珠蛋白生成障碍性贫血，基因型为纯合子β地/β地，两个β基因都发生突变，使其不能合成正常的β珠蛋白，没有血红蛋白A的合成，患者几乎靠输血维持生命。 β珠蛋白生成障碍性贫血，又称为β+珠蛋白生成障碍性贫血，其基因型为杂合子β地/β，其中一个基因正常，贫血症状较轻。β地中海贫血常见突变位点2．分子诊断方法PCR和基因点突变检测技术是β地中海贫血基因诊断的主要手段，常用的方法有：（1）PCR-RDB法(反向斑点杂交)：先将探针固定在尼龙膜上，再将待测的

DNA样本(一般是经PCR扩增的产物)与之杂交，一次就可以判断某一基因的各种突变情况。扩增的引物为：Bio-C1

：GTACGGCTGTCATCACTTAGACTTCA-3′Bio-C2

：5′-402bp5′-TGCAGCTTGTCACAGTGCAGCTCACT-34′23bpBio-C3：5′-GTGTACACATATTGACCAAA-3′Bio-C4：5′-AGCACACAGACCAGCACGTT-3′中国人中已发现有21种β珠蛋白基因的突变型，使用固化在膜上的11种探针可以检测出98%以上的中国人β地中海贫血突变基因型。（2）PCR-ASO法：当基因的突变情况完全明了时，可以合成等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific

oligonucleotide,ASO），长度通常为

20bp左右。一种探针与正常基因杂交，另一种探针与突变基因杂交，即将突变的基因区别开来.PCR先将含有突变点的基因进行扩增，然后再与ASO探针作点杂交。优点是灵敏、难确，缺点是一次杂交只能检测一种突变。（3）等位基因特异性PCR（ASPCR）:TTTATTTAAATAAAGGC产物AAAAAAAGGCTTTTTTT产物正常引物突变引物PCRPCR无突变突变杂合子（4）芯片技术多采用PCR体外扩增结合DNA芯片反向点杂交检测技术，可快速准确检测人临床全血样本中β珠蛋白基因上多个基因位点的突变。遗传性乳腺癌相基因突变2013年切除乳腺2015年切除卵巢和输卵管BRCA1安吉丽娜·朱莉Let’s

Do

PCR!美国前副总统汉弗莱<Humphrey)在1967年发现膀胱内有一肿物，病理切片未发现癌细胞良性“慢性增生性囊肿”，未进行手术治疗。九年后，他被诊断为患有“膀胧癌”，两年后死于该病1994年，研究者用灵敏的PCR技术对上述汉弗莱1967年的病理切片进行了P53抑癌基因检查，发现那时的组织细胞虽然在形态上还没有表现出恶性变化，但其P53基因的第227个密码子已经发生了一个核苷酸的突变。就是这个基因的微小变化，使其抑癌功能受损，导致九年后细胞癌变的发生。这说明，在典型症状出现之前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表现出来了P53抑癌基因思考题遗传性疾病的分子诊断策略全国高等医药院校教材-分子诊断学基因治疗Genetherapy狭义概念将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。第一节

基因治疗的概念及其策略一、基因治疗（

Gene

therapy）概念广义概念将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。分子缺陷清楚可以得到相应基因的克隆病理生理机制已知有利的风险-利益比治疗基因可以被调控合适的靶细胞有效安全相关法规健全基因治疗的必备条件：基因矫正（gene

correction）对于致病基因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能；基因置换（gene

replacement）用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态；基因增补（gene

augmentation）将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能，但致病基因未去除；基因表达调节（modulation

）指将特定的反义核酸、RNA干扰或核酶等技术抑制目的基因表达从而消除致病基因的作用。第一节

基因治疗的概念及其策略二、基因治疗的总体策略针对致病基因而言第一节

基因治疗的概念及其策略二、基因治疗的总体策略针对非致病基因而言自杀基因这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞受体细胞杀死，这种基因被称为“自杀基因”。自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。免疫基因治疗将某些细胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。耐药基因治疗在肿瘤化疗过程中，把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。More……第一节

基因治疗的概念及其策略二、基因治疗的总体策略Germ

line

gene

therapyIn

the

case

of

germ

line

gene

therapy,

Germ

cells,

i.e.,

sperm

or

eggs,are

modified

by

the

introduction

of

functional

genes,

which

are

integratedinto

their

genomes.

Therefore,

the

change

due

to

therapy

would

beheritable

and

would

be

passed

on

to

later

generations.

This

new

approach,theoretically,

should

be

highly

effective

in

counteracting

genetic

disordersand

hereditary

diseases.

However,

many

jurisdictions

prohibit

this

forapplication

in

human

beings,

at

least

for

the

present,

for

a

variety

oftechnical

and

ethical

reasons.Somatic

gene

therapyIn

the

case

of

somatic

gene

therapy,

the

therapeutic

genes

aretransferred

into

the

somatic

cells

of

a

patient.

Any

modifications

andeffects

will

be

restricted

to

the

individual

patient

only,

and

will

not

beinheritedby

the

patient's

offspring

or

later

generations.第二节基因治疗的基本程序第二节

基因治疗的基本程序基因治疗的两种途径载体目的基因in

vivoex

vivo靶细胞1、间接体内治疗途径（ex

vivo）是先从患者体内取出某一器官组织的细胞，体外扩增后，将目的基因转入靶细胞形成表达外源基因的遗传修饰细胞，选择高表达的细胞扩增培养，以一定数量移植患者体内。（安全、易控制但操作复杂）2、直接体内治疗途径（in

vivo）将目的基因体内直接转移到靶细胞，所用载体必须具有特异的导向性和转移效率。（操作简单但疗效短、免疫排斥等）第二节基因治疗的基本程序目的基因的选择和获取目的基因与转运载体结合靶细胞的确认载体携带外源基因进入细胞外源基因的整合外源基因的表达及检测治疗作用及稳定性、安全性评价第二节

基因治疗的基本程序第二节

基因治疗的基本程序一、目的基因在了解疾病发生的分子机制基础上，选择对疾病有治疗作用的特定基因。如对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因即可用于治疗；对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗。治疗性基因获得的方法很多：用酶切或探针杂交法从基因组DNA文库获得，从cDNA文库获取，PCR扩增，人工合成等。基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒载体、疱疹病毒载体等非病毒载体：裸露DNA、脂质体、分子耦联载体、染色体载体、多聚物、纳米载体等。与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。第二节

基因治疗的基本程序二、转运载体第二节

基因治疗的基本程序二、基因的转运Safety:

deletion

of

a

part

of

the

viral

genome

critical

for

viralreplication.

Such

a

virus

can

efficiently

infect

cells

but,

once

theinfection

has

taken

place,

requires

a

helper

virus

to

provide

themissing

proteins

for

production

of

new

virions.Low

toxicity:

The

viral

vector

should

have

a

minimal

effect

on

thephysiology

of

the

cell

it

infects.Stability:

Some

viruses

are

genetically

unstable

and

can

rapidlyrearrange

their

genomes.Cell

type

specificity:

Most

viral

vectors

are

engineered

to

infect

aswide

a

range

of

cell

types

as

possible.Identification:

Viral

vectors

are

often

given

certain

genes

that

helpidentify

which

cells

took

up

the

viral

genes.

These

genes

are

calledMarkers,

a

common

marker

is

antibiotic

resistance

to

a

certainantibiotic.第二节

基因治疗的基本程序二、基因的转运（逆转录病毒载体）LTR

ψLTRgagpolenv逆转录病毒载体

1、逆转录病毒载体的结构逆转录病毒载体的特点结构和感染过程与普通逆转录病毒相似；可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞；感染靶细胞后不扩散；假病毒感染靶细胞的效率非常高；不感染非增殖细胞。第二节

基因治疗的基本程序二、基因的转运（逆转录病毒载体）同时也存在一定的缺点:①容量小，只能容纳8kb-10kb的外源基因片段；②血清补体能使之失活；③病毒滴度低，低于治疗大肿瘤需要的滴度；④病毒整合到DNA后，可能引起插入突变和激活癌基因的可能；⑤宿主范围有限，只感染增殖细胞，故在应用上有一定局限性。第二节

基因治疗的基本程序二、基因的转运（逆转录病毒载体）慢病毒(HIV)载体

Lentivirus优点：高效感染宿主细胞，并且其感染范围广；能逃避人体免疫系统的监视，从而防止免疫排斥缺点：引起抑癌基因的受抑和原癌基因的激活，以及对细胞的毒性和产生变种病毒第二节

基因治疗的基本程序二、基因的转运腺病毒载体

1、结构E1AE1BE2BE2AE4E3L1~L5第二节

基因治疗的基本程序二、基因的转运二、基因的转运（腺病毒载体）2、腺病毒载体特点宿主范围广腺病毒蛋白表达不以宿主增殖为必要条件可获得高病毒效价重组体非常稳定不会引起肿瘤有较高的安全性无包膜，不易被补体灭活，可直接在体内应用不整合入染色体第二节

基因治疗的基本程序病毒载体生物学特性适用范围反转录病毒载体单链RNA

病毒8~10kb可感染分裂细胞；整合到染色体中；表达时间较长；

有致癌的危险；Exvivo

基因治疗；肿瘤基因治疗。腺病毒载体双链DNA

病毒36kb可感染分裂和非分裂细胞；不整合到染色体中；

外源基因表达水平高；表达时间较短；免疫原性强；Invivo

基因治疗；肿瘤基因治疗；疫苗。AAV

病毒载体单链DNA

病毒~5kb可感染分裂和非分裂细胞；整合到染色体中；无致病性；免疫原性弱；可长期表达外源基因；在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组织中表达较高；In

vivo

基因治疗；Exvivo

基因治疗；遗传病基因治疗；

获得性慢性疾病的基因治疗。慢病毒载体单链RNA

病毒>10kb整合到染色体中容量大；可感染分裂和非分裂细胞；无免疫原性血液病的治疗肿瘤的基因治疗。脂质体脂质体载体是用人造双层磷脂质，包装DNA后形成的脂质体-DNA复合物。脂质体载体无毒无抗原性，目的基因与脂质体的包裹使其可以免受核酸酶降解，容量大，可单独或联合其他载体使用，并可通过静脉注射使目的基因进入特定部位。缺点：表达时间短，不能通过血脑屏障。第二节

基因治疗的基本程序二、基因的转运分子耦联载体分子耦联载体由DNA、DNA结合因子和配体三部分组成。配体与特异的受体结合，经受体介

导的细胞内吞途径，将目的基因转移至细胞内。缺点：DNA易被降解，降低了基因转移效率；靶向性不高第二节

基因治疗的基本程序二、基因的转运多聚物载体多聚物载体是利用带正电荷的多聚阳离子与带负电荷的

DNA相结合，形成稳定的多聚复合物，使DNA不易被核酸酶降解，并可与细胞表面带负电荷的受体相结合，而被摄入到细胞中。聚合物聚乙烯亚氨(PEI)：PEI分子量的增加，其对细胞的转染效率和细胞毒性同时增加；聚乙二醇(PEG)：降低PEI的毒性；聚D，L22，42二氨基丁酸(PDBA)：一种新型多聚物基因载体第二节

基因治疗的基本程序二、基因的转运裸露质粒DNA将裸露质粒DNA直接注入肌肉，外源基因在肌肉中的表达量与注入的外源基因含量成正比，与溶液体积无关。第二节

基因治疗的基本程序二、基因的转运染色体载体一些参与哺乳动物基因表达和复制的染色体成分如转座子、基因隔离子、增强子、基因座控制区、核骨架结合区以及基质结合区等在转基因实验中，均被用来设计载体，并整合入基因组而发挥作用。转座子是一类小的DNA片段，可以在染色体不同的区域移动并携带遗传信息；转座子的整合位点具有可预测性，从而提高转基因治疗的安全性。第二节

基因治疗的基本程序二、基因的转运1.细胞转导肽介导基因导入系统蛋白质之所以能够进入细胞，就是因为在它们的结构中含有能够携带生物大分子进入细胞的多肽-细胞转导肽。如果将这个多肽结构和目的基因结合，它就能将目的基因带入靶细胞。细胞转导肽的表达效率高，但价格昂贵，稳定性差，在一定程度上限制了它的应用。第二节

基因治疗的基本程序二、基因的转运（其他新型载体）2.纳米微生物技术基因治疗载体纳米微生物具有许多优点：

1)纳米脂质体主要由磷脂以及胆固醇合成，可以通过与细胞膜的融合或者胞吞作用将目的基因导入靶细胞；

2)纳米微生物材料具有生物兼容性和可生物降解性，在传递过程中无毒，无免疫原性，并且可以通过新陈代谢降解，因此不会对细胞产生毒性；

3)通过调节纳米材料的降解速度，还可以控制目的基因的释放速度，延长其治疗效果；

4)纳米基因载体比表面积大，并可在表面偶联靶细胞的配体

或抗体，实现基因治疗的主动靶向性，大大提高基因传递的

特异性和加强靶细胞对目的基因的摄取。第二节

基因治疗的基本程序二、基因的转运（其他新型载体）选择靶细胞的原则是：

1）必须较坚固，足以耐受处理，并易于由人体分离又便于输回体内；

2）具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，最后可延续至病人的整个生命期；

3）易于受外源遗传物质的转化；4）在选用反转录病毒载体时，目的基因表达最好具有组织特异性的细胞。目前使用得较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等。第二节

基因治疗的基本程序三、靶细胞的选择干细胞一种具有复制能力、可以形成各种组织的早期未分化细胞Embryonic

stem

cells

(ES)

胚胎干细胞4~5

d

胚泡内细胞团（inner

cell

mass

of

blastocyst）具有自我更新和分化为任何类型组织细胞的能力（全能性）Pluripotent

stem

cells

多能干细胞5

~10

W

fetus

(

Embryonic

germ

cells)外层细胞→胚胎等与发育相关组织内细胞团→人体所有器官Special

stem

cells

专能干细胞adult (adult

stem

cells,

AS)hematopoietic

stem

cell

(HSC)neural

stem

cell

(NSC)mesenchymal

stem

cell

(MSC)骨髓干细胞骨髓中至少含有两种干细胞：造血干细胞

Hematopoeitic

stem

cells（HSC）骨髓间质干细胞Bone

marrow

stromal

cells（MSC）HSC一般处于静止期，必要时才进入细胞周期多能干细胞 (造血干细胞,

HSC)定向干细胞 (造血祖细胞,HPC)成熟的终末细胞红系祖细胞巨核系祖细胞单核系祖细胞 具有可移植性和自我更新能力，在体内永不耗竭，只需单次治疗； 具有多能性，可分化为粒、红、淋巴和血小板等各种血细胞，且在分化过程中保持基因组的相对稳定，使目的基因随细胞的分化成熟而相对扩增，病人可终身受益；外源基因表达产物可通过血液循环遍布全身；造血干/祖细胞的功能活性可在体内外进行分析； 取材于自体骨髓或脐带血，易于获取也便于植回并存活，临床已有成熟技术骨髓中的非造血干细胞，能分化成多种中胚层来源的间质细胞（骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等）MSC在体内可定向成骨、成软骨或成肌腱分化，可能是不同组织的微环境含有不同因子，促进MSC向不同谱系分化。

MSC体外易于分离和培养，回输体内后可定位于骨髓并通过自我更新而长期存活，因而可作为理想的靶细胞用于基因治疗（直接移植MSC可治疗骨和软骨的疾病）骨髓间质干细胞成纤维细胞成纤维细胞是一种容易获得和在体外培养并进

行遗传修饰的细胞。经修饰的细胞又容易移植

回体内，必要时还可将已植入的细胞重新移走，使其介导的基因治疗终止。已有多种细胞因子基因被转移到小鼠皮肤成纤 维细胞，然后再移植回小鼠。这些细胞再体内 持续分泌细胞因子，使小鼠对肿瘤的免疫功能 明显增强。遗传修饰后的成纤维细胞也可移植入脑内，以治疗神经系统疾病国内薛京伦等以逆转录病毒为载体，将人凝血因子IX cDNA 在体外转移到两例血友病患者的皮肤成纤维细胞中，用胶原基质包埋后再自体移植回体内，结果IX因子在体内持续高水平表达2年以上，使两患者的出血症状得到不同程度减轻。肌细胞骨骼肌优点：最常用的注射途径，对外源药物耐受力强；面广量大又位于体表易于操作，是表达外源基因的良好场所。外周血淋巴细胞（peripheralblood

lymphocyte，PBL）主要优点： 易于从体内取出和回输。应用IL-2尚可使PBL在体外进行培养并扩增，从而获得足够数量以适应体外操作。 PBL对目前常用的RV,AAV等都有一定敏感度，可被有效导入外源基因，并可耐受筛选。 筛选出转导成功的细胞回输体内可继续存活，应用

IL-2可使之继续生长且有功能。世界上首例遗传病的基因治疗：ADA缺乏症（SCID）淋巴细胞物理方法膜融合法

病毒载体法质粒DNA直接转移法磷酸钙法化学方法DEAE－葡聚糖法电穿孔法粒子轰击法（基因枪法）第二节

基因治疗的基本程序四、载体携带外源基因进入细胞第二节

基因治疗的基本程序五、外源基因的整合不整合整合随机整合定点整合第二节

基因治疗的基本程序六、外源基因的表达及检测（一）DNA印迹技术(Southernblotting)用于外源基因的整合分析。（二）RNA印迹技术(Northernblotting)用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。第二节

基因治疗的基本程序七、有效性、稳定性和安全性评价动物模型临床试验第三节、基因治疗的现状进行基因治疗必须具备下列条件：

1)选择适当的疾病，并对其发病机理及相应基因的结构功能了解清楚；

2)纠正该病的基因已被克隆，并了解该基因表达与调控的机制与条件；

3)该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达；4)具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用的动物模型。今20年来基因治疗的成果1腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID)病因:淋巴细胞缺乏ADA酶腺苷、dATP堆积破坏免疫功能患儿很少活到成年第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH)治疗策略：淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10%维持免疫系统功能改善病人症状XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在

Xq26.3-q27.2。临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。发病率为

1/30000。例如：我国学者薛京伦实施的FⅨ的基因治疗。第三节、基因治疗的现状二、乙型血友病逆转录病毒载体+FⅨcDNA重组体5`

LTR

FⅨ

neo

SV

PSOLTR

3`①导入仓鼠细胞（CHO）→FⅨ表达；②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞→FⅨ表达；③91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞→回植病人皮下→FⅨ基因表达，FⅨ基表达水平达正常人的5%。是我国基因治疗成功的例子。第三节、基因治疗的现状二、乙型血友病①IL-2

Gene（白介2）②TNF-Gene（肿瘤坏死因子）逆转录病毒载体导入TIL（体外培养的自体细胞）回植患者体内TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞的作用。第三节、基因治疗的现状三、黑色素瘤的基因治疗是指利用人工合成的反义RNA和反义DNA来阻断基因的转录或复制，控制细胞生长在中间阶段，使编码蛋白质的基因能转录为mRNA，因而不能翻译成相应的蛋白质，以达治疗某一疾病的目的第三节、基因治疗的现状四、反义技术第三节、基因治疗的现状五、基因编辑技术基因编辑技术及基因编辑的三大利器：ZFN（锌指

核酸酶）、TALEN（转录激活样效应因子核酸酶）

和CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复技术）。

CRISPR技术在今年被《Nature

Methods》评为在过去十年中对生物学研究影响最深的十大技术之一。全球首例！“基因编辑”治疗白血病第四节、基因治疗的靶向性靶向性基因载体的作用原理靶向性是指在治疗过程中，把治疗作用或药物效应限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响其他正常的细胞、组织或器官的功能。靶向性载体在这里不仅仅起一个靶向作用，还要通过各自的不同作用力和DNA分子链结合形成一个相对紧密的复合物粒子，使其更容易穿过细胞膜并且免受核酸酶的降解。第四节、基因治疗的靶向性一、靶向性基因载体的作用原理三个步骤：

1.靶向性载体和目的基因以适当比例混合，通过静电荷力、分子间作用力等结合力结合在一起，使链状的DNA分子折叠，形成粒状的复合物。复合物在靶向性基团的引导下接近靶细胞，通过细胞的内吞或者吞噬作用进入细胞内部，在细胞内紧密的复合物可以保护DNA避免核酸酶的降解。靶向性载体和目的基因脱离，目的基因通过核膜孔或者是在细胞分裂过程中进入细胞核，修补缺失基因或者关闭异常基因，而靶向性载体则分解成小分子化合物通过细胞的新陈代谢排出细胞。理想的基因载体应具备以下特点：

1)靶向特异性，并且不易被免疫系统识别；高度稳定，容易制备，可浓缩和纯化；安全，无毒性，对人体以及环境无危害；有利于基因高效转移和长期表达。第四节、基因治疗的靶向性二、靶向性基因载体的选择靶向性基因载体的安全性在携带目的基因进入靶细胞后，某些基因载体并不能马上分解，滞留在细胞内影响细胞正常的新陈代谢，甚至引起基因突变从而杀死正常细胞乃至对人体的生命安全产生危害。尤其是病毒载体，存在着较为明显的安全问题：病毒载体中可能产生有传染性、野型或辅助型病毒；可能随机整合于宿主基因组中，从而活化癌基因