新生儿中枢神经系统感染患儿脑脊液病原菌谱、血清型及耐药特点

新生儿中枢神经系统感染患儿脑脊液病原菌谱、血清型及耐药特点

脑瘫是儿童严重的感染疾病，死亡率和致残率很高。WHO估计全球每年至少有120万中枢神经系统细菌感染病例,儿童是这一疾病高发人群。国外报道,脑膜炎奈瑟菌、B型流感嗜血杆菌及肺炎链球菌是引起的中枢神经系统细菌感染3种主要病原菌,所占比率达80%以上。革兰阴性杆菌特别是大肠埃希菌、其他链球菌(肺炎链球菌以外)、产单核细胞李斯特菌和葡萄球菌也较常见。由于脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌及肺炎链球菌是苛养菌,培养阳性率较低,为增加3种病原菌检出率,我们前期报道采用抗原检测法可提高脑脊液中上述病原菌的检出率。本研究采用灵敏度及特异度更高的实时定量PCR方法检测脑脊液中脑膜炎奈瑟菌、B型流感嗜血杆菌及肺炎链球菌,并对分离株进行耐药及血清型分析。材料和方法一、膜炎患者年龄分布2005年1月—2006年12月共收集到118例临床诊断脑膜炎(不包括病毒性脑膜炎)患者。其中门诊10例,住院108例。年龄分布10d～11岁,新生儿患者28例。化脓性脑膜炎、结核性脑膜炎及隐球菌脑膜炎诊断参照《儿科学》诊断标准。二、培养基和菌株对118例患者脑脊液进行细菌培养,培养基采用5%脱纤维羊血哥伦比亚培养基及巧克力培养基(法国生物梅里埃公司)、沙保罗培养基、罗琴培养基(上海市伊化实验诊断试剂公司)。初次分离培养条件为5%CO2,35℃,48～72h,真菌、结核分枝杆菌分离培养条件分别为35℃观察7d及60d。细菌鉴定采用API生化反应系统(法国生物梅里埃公司提供)。标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922,肺炎链球菌ATCC49619,流感嗜血杆菌ATCC49247。三、瞳菌病毒dna提取标准品菌株采用肺炎链球菌ATCC49619,流感嗜血杆菌ATCC49247及本院细菌室临床分离脑膜炎奈瑟菌株,并通过生化试验、血清学及基因测序证实为脑膜炎奈瑟菌。标准品菌株DNA提取采用热裂解法,挑取3～5个过夜培养的细菌菌落,混悬入100μL纯水中。95～98℃煮沸5min。12000～16000r/min离心10min。提取上清液加入新管备用,-70℃保存。脑脊液标本DNA提取采用QIAGEN试剂盒(上海QIAGEN公司),操作步骤参照试剂盒说明。四、基因表达、回复突变tps采用GoldTaq试剂盒(ABI公司)及ABI7000实时定量PCR仪检测系统。PCR体系:PCR引物各10μmol/L,标记探针10μmol/L,dNTPs25mmol/L,模板2μL,镁离子25mol/L,BSA250mg/μL,10×buffer5μL,加去离子水,使终体积50μL。第1程序参数为加热95℃,10min,第2程序参数是95℃15s,60℃1min,42个循环。β肌动蛋白基因作为内参照。检测病原菌为流感嗜血杆菌(b及c型);肺炎链球菌(1-9,10A,11A,12,14,15B,17F,18C,19);脑膜炎奈瑟菌(A,B,C,29E,W135,X,Y,Z)。引物及探针序列见表1。五、血清分类肺炎链球菌血清分型采用荚膜肿胀试验,流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌血清分型采用OXOID试剂盒,操作按说明书进行。六、培养基和判断标准肺炎链球菌青霉素敏感试验采用E试验法,其他病原菌采用K-B法,药敏试验选用药物参见结果中所述。药敏纸片及青霉素E试验均由OXOID公司提供。肺炎链球菌药敏试验培养基采用5%脱纤维羊血MH培养基,流感嗜血杆菌采用HTM培养基,余选用MH培养基(上海祥和生物诊断技术有限公司)。判断标准参照2005、2006年版CLSI判断标准。药敏试验质控菌株选用肺炎链球菌ATCC49619、流感嗜血杆菌ATCC49766、大肠埃希菌ATCC25922及金葡菌ATCC25923,质控菌株由上海市临床检验中心提供。七、内酰胺酶检测β内酰胺酶(OXOID)溶液40μL与被测菌混匀,室温下变成红色为阳性,不变色(黄色)为阴性。八、统计方法病原菌抗菌药物耐药性统计采用WHONET5统计分析软件。结果一、实时定量pcr检测试验结果118例脑脊液标本中,新生儿患者28例。41例患儿病原菌培养或实时定量PCR检测阳性。结果提示新生儿患者大肠埃希菌阳性率21.4%,占新生儿病原菌总数54.5%,其次是肺炎链球菌,阳性率7.1%,占病原菌总数18.2%。1个月至11岁患儿肺炎链球菌阳性率16.7%,占该组病原菌总数的50%,其次是脑膜炎奈瑟菌,阳性率5.6%,占该组病原菌总数的16.7%,结果见表2。118例脑脊液标本中,肺炎链球菌实时定量PCR检测阳性17例,其中5例同时分离到肺炎链球菌,其余12例仅实时定量PCR阳性,培养阴性。脑膜炎奈瑟菌实时定量PCR检测阳性5例,3例同时培养阳性,2例仅实时定量PCR阳性。流感嗜血杆菌培养及实时定量PCR检测结果一致,均为2例,结果见表3。二、抗菌药物敏感试验分离到的2株流感嗜血杆菌均为b型,1株β内酰胺酶阳性,对氨苄西林、头孢克洛耐药,对头孢噻肟、氯霉素、阿奇霉素敏感,1株为β内酰胺酶阴性,对上述抗菌药物敏感。5株肺炎链球菌为19F型,2株为青霉素中介肺炎链球菌(PISP),3株为青霉素敏感肺炎链球菌(PSSP),青霉素MIC50为0.023mg/L,MIC90为0.75mg/L,对红霉素及克林霉素均耐药,对左氧氟沙星、万古霉素敏感。3株脑膜炎奈瑟菌中2株A群,1株C群。三、抗菌药物敏感试验大肠埃希菌ESBL阳性率68%,对阿米卡星、阿莫西林-克拉维酸、头孢哌酮-舒巴坦及亚胺培南敏感;对环丙沙星耐药率40%。表皮葡萄球菌对苯唑西林均耐药。铜绿假单胞菌对哌拉西林、氨基糖苷类、头孢菌素类、碳青霉烯类抗生素均敏感。草绿色链球菌对青霉素敏感,对红霉素耐药。土生克雷伯菌对头孢西丁、阿莫西林-克拉维酸、头孢唑林及头孢克洛耐药。星形奴卡菌对庆大霉素、克林霉素、复方磺胺甲口恶唑及左氧氟沙星敏感。血清型及基因型检测结果细菌性脑膜炎是我国儿童常见的严重中枢神经系统感染性疾病,各地报道的病原菌检出率及病原菌种类差异较大。广西南宁前3位病原菌为金葡菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌。杭州地区以金葡菌、肺炎链球菌和大肠埃希菌为主要病原菌。北京地区采用培养及抗原检测法发现脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌及肺炎链球菌是儿童化脓性脑膜炎前3位病原菌。本研究结果提示,2005—2006年度,我院新生儿组与非新生儿组患儿脑脊液病原菌谱存在明显不同。新生儿组脑脊液病原菌检测总阳性率39.3%,大肠埃希菌感染阳性率21.4%,占该组病原菌总数54.5%。新生儿肺炎链球菌感染患者7.1%,占细菌总数18.2%,同时检测到b型流感嗜血杆菌、表皮葡萄球菌及土生克雷伯菌,未检出脑膜炎奈瑟菌。1个月至11岁年龄组脑脊液病原菌检测总阳性率33.3%,肺炎链球菌阳性率16.7%,占该组病原菌总数50%,脑膜炎奈瑟菌阳性率5.6%,占病原菌总数16.7%,铜绿假单胞菌阳性率3.3%,占病原菌总数10%,3种病原菌分别占1个月至11岁年龄组病原菌的前3位。肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌血清型分析提示,5株肺炎链球菌均为19F型,2株流感嗜血杆菌为b型,2株脑膜炎奈瑟菌为A群及1株为C群。分离到肺炎链球菌,2株对青霉素中介,4株大肠埃希菌ESBL阳性。我们研究发现,单独采用细菌培养方法会导致肺炎链球菌、流感嗜血杆菌及脑膜炎奈瑟菌漏检。国外研究报道,采用实时定量PCR方法检测脑脊液中肺炎链球菌、流感嗜血杆菌及脑膜炎奈瑟菌具有较高的特异度及灵敏度。本研究在引物及探针设计、探针标记、实时定量PCR程序及检测仪器等参数均参照国外研究报道方法进行。研究结果表明,采用实时定量PCR方法可将肺炎链球菌阳性率从培养的4.2%阳性率提高到14.4%检出率,脑膜炎奈瑟菌从培养的2.5%,提高到4.2%。此外实时定量PCR方法同培养法相比诊断时间可明显缩短。因此我们建议推广实时定量PCR