遗传咨询师课件-遗传标记检测方法及连锁分析-王磊

王磊复旦大学生物医学研究院复旦大学现代人类学教育部重点实验室wangleiwanglei@遗传标记检测方法及遗传分析真实临床案例1：一对河南夫妇连续两次怀孕生下全身骨质松软的胎儿后，来医院就诊，询问提前干预方法(取自

2015.1.15号复旦附属红房子医院内分泌门诊)真实临床案例2：一对连云港夫妇连续三次生下表现为吞咽困难的婴儿，几个小时候婴儿死亡。第四次发现怀孕，就诊询问医生胎儿情况

(取自2014.12月底复旦附属红房子医院集爱中心)他们该怎么办？遗传咨询分会成立的背景中国遗传学会遗传咨询分会成立的背景出生缺陷全国约1600万出生缺陷儿，发生率达5.6%世界性的严重公共卫生和社会问题如何降低出生缺陷率？不孕不育全国不孕不育，发生率达12.5-15%不孕不育患者人数超过5000万辅助生殖(IVF)一次成功率只有30%左右中国遗传学会遗传咨询分会成立的背景如何筛选出“优质”胚胎？恶性肿瘤我国肿瘤发生率约6.4%全国每年新发肿瘤约312万，每分钟有6人被诊断恶性肿瘤中国遗传学会遗传咨询分会成立的背景如何有效预知并预防肿瘤？中国遗传学会遗传咨询分会成立2015.2.9日遗传咨询分会成立的背景遗传咨询：是联合人类基因组技术，人类遗传学，为病人开展遗传咨询、基因诊断、遗传病治疗等相关医学服务。遗传咨询必不可少！如何寻找疾病的基因？单基因遗传病及致病基因的克隆有雀斑vs

无雀斑直发

vs

卷发左撇子13侏儒症掌跖角化香港时尚模特女孩Chiu(白化病)短指症Waardenburg神经纤维瘤病人类的多指畸形症史蒂芬·威廉·霍金肌萎缩性侧索硬化症英国维多利亚女王及其家族血友病鱼鳞病单基因疾病(如镰状红细胞贫血)主要发生在新生儿和幼儿阶段多基因疾病(如精神分裂症)主要发生在成人时期遗传病是多种疾病和死亡的重要原因单基因疾病是指那些由于单个基因的突变而引起的遗传病由于单基因病发生基本上受一对等位基因的控制，其遗传方式符合孟德尔定律，因此又称为孟德尔遗传病显性遗传隐形遗传Online

Mendelian

inheritance

in

Man常染色体显性遗传常染色体隐性遗传x连锁显性X-连锁遗传Y染色体遗传单基因疾病(孟德尔遗传病)遗传方式：2.性染色体遗传1.常染色体遗传X连锁隐性常染色体显性遗传：致病基因在杂合状态下即可致病患者的双亲中，有一个患者，患者的同胞中，有1/2的可能性为患者无病患个体的后代不会患此病在系谱中，疾病连续相传，无间断现象常染色体隐形遗传：致病基因只有在纯合状态下才致病患者的双亲表型正常，但均为携带者， 患者的同胞对中有1/4的可能性为患者

在系谱中，患者的分布是散在的，通常看不到连续传递的现象连锁显性遗传女性患者的子女有1/2可能发病，男性患者的所有女性后代均发病，男性患者的男性后代均不发病在系谱中，疾病连续传递，无间断现象

X-连锁隐性遗传往往只见到男性患者女性患者的父亲亦为患者，母亲为携带者Each

puzzle

piece

would

represent

a

set

of

genes

organizedin

a

specific

way,

similar

to

a

chromosome.One

way

to

think

about

genesThe

information

carried

in

genes

differs

slightly

from

person

to

persoThis

is

what

makes

each

of

us

unique.

As

a

result,

the

colors

of

thepuzzle

pieces

would

be

different

between

family

members.

The

childreceives

exactly

half

of

its

genetic

information

from

the

mother

andexactly

half

from

the

father.Finding

a

Gene

ontheChromosome

MapMother’s

geneFather’s

geneChild’s

geneGenetic

disorder

runs

in

families8

9

10

11

12Find

the

puzzle

piece

that

is

responsible

for

Disorder3246571Gene

cause

diseaseCollins

FS.

(1992)

Nature

genetics

1:3-6苯丙酮尿症(PKU)：使得苯丙氨酸及苯丙酮酸积蓄并从尿中大量排出，临床伴有智力低下，色素减少等。发病率1/16500STR

SNP等遗传标记

，获定位克隆：通过RFLP

、、取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法克隆基因。先定位、后克隆、 不依赖于现有研究基础基因定位方法家系连锁分析法随着人类基因组图谱已经绘制完成，物理定位法已被查找基因组图谱所取代。但对许多尚未被克隆的致病基因而言，因基因序列未知，其在染色体上无从查找，家系分析成为最基本的定位方法。全外显子测序法随着全基因组测序技术的深入发展，全外显子测序方法寻找致病基

因扮演着越来越重要的角色。家系连锁分析法基本理论准备独立遗传independent

assortment完全连锁complete

linkage交换重组重组型配子重组型配子亲本型配子亲本型配子基因在每条染色体内是直线排列的,染色体可以自由组合，而排在一条染色体上的基因是不能自由组合的。这种特点称为基因的“连锁”两个基因间的重组率与它们的距离有关，相距越近重组率越小，重组率为1%时的遗传距离为1cM，约相当于100万bp。两个基因间的重组率也是相对恒定的，重组率的大小反映基因座在染色体上相对距离。重组值可以通过新组合在整个后代中的比例来推算。重组率介于0-50%之间，但在遗传图上可以看到超过50cM的现象，这是因为两个基因间发生了多次交换。38Ⅲ

-8Ⅳ

-6Ⅱ

-5Ⅲ-2Ⅳ-2Ⅱ

-2Ⅰ

-239连锁分析：是基于家系研究的一种方法，是单基因遗传病定位克隆方法的核心。他是利用遗传标记在家系中进行分型，再利用数学手段计算遗传标记在家系中是否与疾病发生共分离Chrom

.

1Chrom

.

2Chrom

.

3……遗传标记遗传标记第一代遗传标记:限制性片段长度多态性(RestrictionFragment

Length

Polymorphism,RFLP)。第二代遗传标记:微卫星(Microsatellite)，其重复单位长度一般为2－6个核苷酸。分布广﹑数目多﹑具有高度多态性。第三代遗传标记：单核苷酸多态性标记(SNP),数量庞大，分布广泛。42微卫星标记420M9-3663(上)和478B14-848(下)的基因分型图Lod值(对数优势比)：两个基因座按一定的重组率而相互连锁的可能性与两个基因座互不

连锁的可能性之比，这个可能性之比的10作底的对数就是对数优势比LOD=log10

(likelihood

of

data

If

loci

linked

at

9/likelihood

ofdata

if

loci

unlinked

at

9=0.5)0≤9≤0.5LOD

score

=

Z

=

log10

[

θ4

(1-

θ

)+θ

(1-

θ

)4]-5

log

(010LOD值≥＋3被认为是两个基因座肯定连锁的证据。因为LOD值是以10为底区对数计算的，LOD值＋3表明大于或等于1000：1可能性，也就是说，所观察到的连锁不是偶然发生的。LOD值为－2则表示

100：1的连锁机会，被认为是排除连锁的证据。连锁分析常用软件Linkage

packageGenehunterCyrillicFastmap47D2s2177-1.943.133.673.663.132.261.16D2s335-2.182.893.453.462.972.151.10D2s2302-3.241.912.672.832.511.790.80D2s21886.186.095.705.194.082.831.41D2s23146.786.686.255.704.493.121.57D2s23106.786.686.265.704.493.131.57D2s22736.206.115.725.214.102.851.42D2s3642.092.061.911.731.320.860.34D2s1610.290.280.270.250.200.140.08D—2s3—15—

D2s117—

-2—.7—9-12.53-—0.—68

— —

0.—69—-2.94 -0.77—

1.—14

—0.22—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—LOD

SCORE

AT

θ

=—

—

—

—

—

——

—

—

——

—

——

—

——

—

——

——

—

——

—

——

—

——

—Marker0.00.010.050.10.20.30.4——

—

—

—

—————

—

————

————

————

——

————

———

—

———

—

———

—

——

—————1—.27—

—1.0—

0—.52—0.90

0.90

0.55—

—

—举例“The

present

case

demonstrates

that

thelaw

operates

in

man

as

in

plants

andlower

animals.

The

abnormality

is

shown

here

to

be

a

dominant

character”HistoryFamily

and

BDA1

photosin

Farabee’s

dissertation无大家系怎么办？全外显子组测序举例连锁分析：需大家系；定位后隐藏有数个基因全外显子组测序：生物信息学分析；致病位点遗传异质性(Locus

heterogeneity)家系的连锁分析+特定区域全外显子组测序遗传疾病的致病基因突变克隆孟德尔遗传病致病基因的意义为揭示基因功能、调控方式提供最直接的证据为早诊断、产前诊断提供标志物为相关药物开发提供药物靶标多基因遗传病及致病基因的寻找/GWAStudies/精神分裂症糖尿病高血压风湿性关节炎等老年黄斑变性肥胖多基因疾病：由多个基因与环境因子共同作用所引起的遗传性疾病。它包括由一个主基因和其他基因加上环境因子共同作用所引起，以及由相当多的微效基因共同参与加上环境因子所引起。其遗传方式复杂，很难在一个家族中确定正常个体和患病个体。只有通过对大量病人进行研究后，方能确定遗传因子在多基因病发生中的作用。多基因遗传要点：⒈数量性状的遗传基础是两对以上基因⒉这些基因之间没有显，隐性的区别，而是共显性⒊每个基因对表型的影响很小，称为微效基因⒋微效基因具有累加效应，即一个基因对表型作用很小，但若干个基因共同作用，可对表型产生明显影响⒌每对基因的行为都遵循三大定律⒍不仅遗传因素起作用，环境因素也具有明显作用。大多数疾病是多基因疾病－－多种基因和环境共同作用的疾病－－－复杂的机制少数单基因疾病环境基因non-medelian

traitsMany

genesmodified

by

environmenteffectAssociation

studyClassical

medelian

traits2

or

more

allele

of

a

geneWith

little

or

noenvironment

effectLinkage

studyQualitative

traits

and

quantitative

traits质量性状

数量性状Complex

disease

and

quantitative

traitsCommon

disorders

are

quantitative

traits

！Obesity-----？Hypertension-----？Depression------？Schizophrenia,

autism,

arthritis,

et

al(

Endophenotype

or

intermediate

phenotype)Complex

disease:Mutiple

genes

with

subtle

effectsEnviroment

factorsQuantitative

traitsMethod

for

identifying

genes

in

complex

diseaseCase-control

designAssociation

study:

Family-based

designQuantitative

trait

associaHeritabilitySingle

Nucleotide

Polymorphism(SNP)(allele、genotype)Linkage

DisequlibriumHaplotypeTag-SNPHardy-

Weinberg

Equilibrium多基因疾病的遗传率(度)

(heritability)在多基因遗传病中，易患性的高低受遗传基础和环境因素的双重影响，其中遗传因素所起作用的大小程度称为遗传度或遗传率。在多基因病中，遗传率可高达70%-80%；遗传率为

30%~40%或更低，表明环境因素在决定发病上更为重要，遗传因素的作用不显著。遗传度：高血压 MZ同病一致率：

0.6DZ同病一致率：0.30.6表6-7人类一些性状的遗传力性状遗传力性状遗传力身材0.81理科天赋0.34坐高0.76数学天赋0.12体重0.78文史天赋0.45口才0.68拼写能力0.53IQ(Binet)0.68先天性幽门狭窄0.75IQ(Otis)0.80精神分裂症0.80唇裂0.76糖尿病0.75高血压0.62冠状动脉病0.65Single

Nucleotide

Polymorphism人类基因序列的变异大多是单核苷酸的变异。不同人群中

SNP的频率分布有差异，而这些差异可以代表某一人群的遗传差异。因此，探测SNP的工作可以看作是对人类“遗传路标”(genetic

signposts)的勘定。大多数SNPs是单纯多态性purepolymorphic，但也有一些与疾病的发生有关联causative

mutations一般而言，SNP是指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种 不同碱基，其中最少一种在群体中的频率不小于1％在人类基因组中大概每1000

个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP

总量大概是3

×106

个。

The

most

commonsources of

genetic

variation

between

humanG

T

G

GTTIntronic

SNP

–

iSNP

–

does

not

cause

an

amino

acid

changeRegulatory

region

SNP–effect

amount

of

protein

expressed

or

if

expressed.Coding

region：Also

cover

synonymous(同义的)and

non-synonymousSNPTGGGTGT

G

T

G

T

GCoding

SNPSNP的类型Mis-

sense

SNPT

h

rT

h

rT

G

G

T

G

THisGlnSNP是继人类基因组计划之后又一国际研究竞争新热点，是阐明基因组功能及特点的重要基础。SNP是人类基因组DNA序列变异的主要形式，是决定人类疾病的重要遗传基础。以前是争夺基因Linkage

Disequilibrium:A

1

A2

allele

at

locus

1:

PA1;

PA2B1

B2

allele

at

locus

2:

PB1;

PB2If

two

loci

are

independent,

thenPA1B1=

PA1*PB1;

PA1B2=

PA1*PB2………

..If

two

loci

are

dependent,

PA1B1

is

higher

or

lowerthan

PA1*PB1.Thus,

the

two

loci

are

said

to

be

in

LD

(0<D’<1)Haplotype:A

haplotype

is

a

combination

of

alleles

atdifferent

loci

that

are

transmitted

togetheTag-SNP

is

a

representative

SNP

in

a

regionthe

genome

with

high

LDTag-SNPs：Method

for

identifying

genes

in

complex

diseaseCase-control

designAssociation

study:

Family-based

designQuantitative

trait

associaRFLPSNPsmicrosateliteCase-Control

StudyStudy

design

is

very

important

!!Population

substructure

and

selection

biSample

selection

(phenotype

definition)Sample

SizeGenetic

architectureAppropriate

statistical

analysisReplication

of

positive

results

in

an independent

cohortPaper

1(Conventional

case

control

study)Paper

2(Extreme

selection)Family-based

designN=50AC:CC=50:50AC:CC=70:30A/C

or

C/CA/CC/C

病例与对照研究属于回顾性研究，是观察性研究中常用的一种设计方案，是在患有某病的病例组和不患有该病的对照组，或者是在具有某项特征的病例和不具有某项特征的病例中进行，调查过去或最近有无暴露于某因素的历史，而该因素被疑为和该病的发生有联系，或者调查是否存在某因素，而该因素疑为和疾病的某项特征有联系。然后比较两组的暴露情况或具有某因素的情况，验证某因素和疾病是否确实存在联系，联系的性质和程度。病例与对照研究可用于对疾病致病因素或危险因素的调查，药物有害作用的研究， 探讨影响疾病预后的因素等研究。

队列对照研究可采用前瞻性方式，以开始观察的时间为始点，将被观察的人群按其是否接触可能的致病因素或措施，分为两个群体，随访一定时期后，确定并比较各群体中，

新发生病例数或某种效应的差异。

队列对照研究是群体研究中常用的方案，被观察的人群是否接触某种致病因素，是自然分配而形成的两个群体，研究者既不能随机安排，也不可能加以控制。研究对象要有足够的观察时间，在自然病程中要有充分的时间，使危险因素的作用能够表现出来。全部被观察者都必须进行随访，队列中失访人数增加，将会影响所观察的结果。凡在群体中研究可能的致病因素或某项处理措施对固定人群的影响，均可使用队列研究，常用于病因研究，治疗性研究，预防性研究或预后研究。人类复杂疾病研究策略样本选择基因选择SNP选择分型方法选择样本选择：Case-ControlFamily-basedPopulation-basedTwin

StudyCase-Control

StudyTwin

StudyTwin

study:Heritability

and

environmental

factorThe

additional

MZ

individual

can

elevate the

statistical

power

for

association

by to

~40%UCSD

Twin

project

(began

in

2001)5

years

follow

upHeritability

(h2

)

of

environmental

stress

BP

response

intwins:

The

“coldpressortest”

(“CPT”:

one

hand,

0ºC

ice

water,

60

sec)using

Colin

Pilot

hardware

and

ATLAS/

ANS/

TDA

software

.Ice

bucket2.基因选择胰岛素信号通路激素合成代谢通路3.SNP选择How

to

choose

SNPs?Tag-SNPs

(Haploview)Functional

SNPs

(NCBI

SNP)4.分型方法选择分型方法直接测序Taqman探针Massarray分子量阵列技术GWAS：全基因组关联分析Taqman探针Massarray分子量阵列技术

按照分子量来区分不同的核苷酸

dAMP=313.2

DadCMP

=

288.2

DadGMP

=

329.2

DadTMP

=

304.2

Da无需标记，无需电泳成本低，灵敏度高，精确定量MassARRAYm分子量阵列技术平台.有FDA论证，可进行产前诊断的同类仪器仅有MassARRAYm分子量阵列技术平台；. 美国西格诺公司(SEQUENOM

Inc)生产；.

基于飞行时间质谱(MALDI-TOF

MS)技术

按照分子量来区分不同的核苷酸

dAMP=313.2

DadCMP

=

288.2

DadGMP

=

329.2

DadTMP

=

304.2

Da无需标记，无需电泳成本低，灵敏度高，精确定量Maker：Sequenom

IncSetting

date

：2008Room

：307,

Mingdao

BuildingContact

ain

parameter：High

resolution,

High

accuracy,High

sensitivityApplication

：Genotyping,

epigenetics,

gene

expression实验室：明道楼307联系电话要技术指标：高分辨率、高灵敏度、高精度应用范围：基因分型、甲基化、基因表达制造厂商：Sequenom

Inc安装日期：2008Massarray分子量阵列技术平台

基于多重PCR和单碱基延伸技术MassARRAY

iPLEX分型技术36重反应时，每个SNP分型成本远低于测序成本MassARRAY

iPLEX分型技术PCR重数：1~40重(平均33.5)；每个反应所需基因组DNA：<10ng设计成功率：>95%；分型准确率：>99.7%；每天处理样品数：>3000个；可进行定量分析*分子量阵列技术平台主要技术指标检测范围：可对6-40bp核酸片段进行分子量测定和定量分 析。激光器:氮激光器20

Hz离子源:Smart光栅飞行距离:800毫米真空压:5

x

10-6

mbar检测器:电子倍增管高电压关启：数据读取完成后，自动关闭高电压。软件：自动分析数据，直接提供生物学结果。Genome-Wide

Association

Study

(GWAS)通过酶反应的间接杂交直接杂交基于芯片的SNP检测直接杂交法检测SNP或突变

直接杂交方法中，靶序列(荧光PCR产物)根据他们与芯片上探针结合程度的不同区分，杂交条件需要严格控制。细微的序列差异(PM,MM，突变/差异碱基设计在OLIGO正中间)导致了