kozak基因重组智能腺病毒载体的构建及表达研究

kozak基因重组智能腺病毒载体的构建及表达研究

基因治疗是将具有治疗作用的基因或dna（rn）段引入人体的靶细胞，相应地调节不同类型疾病的分子变化，并发挥治疗作用。基因治疗的研究和应用起源于对遗传病的治疗,但近年来肿瘤基因治疗的发展却远远超过了遗传病。常见的抗癌基因有p53、p21、p27、p16、PTEN、FHIT、BRCA1/BRCA2等。由于在人类恶性肿瘤中有50%带有p53基因突变,且p53基因的突变与病情的发展、肿瘤的转移以及对放、化疗的敏感性和预后均密切相关,因此该基因在目前的肿瘤基因治疗研究中倍受关注。p53的基本功能为核转录因子,其抗肿瘤的生物学活性主要表现在阻滞肿瘤细胞周期,可作用于G1/S期和G2/M期,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤血管生成,增强肿瘤细胞的免疫原性,抑制肿瘤细胞的侵袭和转移,增加肿瘤细胞对放、化疗以及热疗的敏感性等。重组人p53腺病毒应用于临床治疗恶性肿瘤已有十几年的历史,虽然取得了一些令人满意的疗效,但疗效尚不十分确切。究其原因,主要是由于p53蛋白在肿瘤细胞中的表达量相对不足所致。本研究利用一种新的重组腺病毒载体系统AdMaxTMHi-IQ,并在基因5′端加入Kozak规则序列,最终同时实现了重组腺病毒的高效包装与p53基因的高效表达。1.材料和方法1.1细胞培养和动物AdMaxTMHi-IQ重组腺病毒载体系统pDC515(io)、pBHGfrt(del)E1、3FLP等质粒和293IQ细胞购自北京本元正阳基因技术有限公司;pUCmT载体购自上海生工生物工程技术服务有限公司;人骨肉瘤Saos-2细胞和人肺癌A549细胞由广州中山大学实验动物中心提供;人p53cDNA由本公司克隆并保存。1.2生物工程技术服务TaKaRaLATaqTMDNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司;Trizolreagent购自invitrogen;FermentasRebertAidFirstStrandcDNASynthesisKit购自上海生工生物工程技术服务有限公司;鼠抗人p53一抗、HRP-人p53二抗购自尚柏生物医学技术(北京)有限公司;Lipofectamine2000转染试剂购自广州展晨生物科技有限公司。1.3koraralataqtmnda分析根据已发表的人野生型p53cDNA全序列,设计合成2条引物,上游引物P1:5′-ATAGGATCCACCATGGAGGAGCCGCAGTC-3′;下游引物P2:5′-ATAGGATCCATGTCAGTCTGAGTCAG-3′,上下游引物中均插入BamHI酶切位点GGATCC和酶切保护碱基ATA,并在上游引物BamHI酶切位点后加入一个A碱基,上游引物内整合入Kozak规则序列CCACCATGG。以上述人野生型p53cDNA为模板,采用TaKaRaLATaqTMDNA聚合酶,通过PCR扩增人p53肿瘤抑制基因编码区,反应条件为:94℃2min;94℃30s,45℃40s,72℃60s,30个循环;72℃延伸5min。PCR产物与pUCmT载体连接,转化大肠杆菌DH5α(深圳市源兴生物医药科技有限公司李进研究员惠赠),蓝白斑筛选pUCm-khp53阳性重组子,再用上游引物P3:5′-AGCACTGTCCAACAACACCA-3′和下游引物P2进行PCR筛选,酶切鉴定后,进行双向测序鉴定。1.4bamhi酶切鉴定用BamHI酶切pUCm-khp53和腺病毒穿梭载体pDC515(io),琼脂糖凝胶电泳后分别切胶,回收插入片段与载体片段,以摩尔比为3∶1的比例连接,转化大肠杆菌DH5α,用引物P3和P2经PCR初筛出阳性克隆,再在载体多克隆位点的上游设计1条与正链一致的引物P4:5′-ACATCCACTTTGCCTTTCTC-3′,在基因内设计1条与正链互补的引物P5:5′-GGGACAGCATCAAATCATCC-3′,基因若正向插入可扩增出片段,若反向插入则无法扩增出片段,以此鉴定基因插入方向,并进行BamHI酶切鉴定。鉴定正确的载体命名为pDC515(io)-khp53。1.5mdv细胞重组人马立克氏体诱导pDC515(io)-khp53腺病毒基因组骨架DNA即pBHGfrt(del)E1,3FLP等质粒的大量扩增、提取、纯化和定量参见文献方法。将293IQ细胞复苏、扩增并铺板,用Lipofectamine2000转染试剂介导pDC515(io)-khp53与腺病毒基因组骨架DNA(DNA总量为800ng,摩尔比为1:1)共转染293IQ细胞,同时设未感染病毒的细胞为阴性对照,8d后共转染孔细胞出现细胞病变,而阴性对照孔细胞生长正常,初步可以判定有重组腺病毒产生,至第10天,共转染孔细胞完全病变,收集病变细胞及上清,-20～37℃之间反复冻融3次。取病毒液感染的293IQ细胞,传代1次,扩增病毒,保存并鉴定。1.6khp33基因缺失菌株对p33的扩增重组腺病毒经热裂解制备模板,以P3和P2为引物,PCR扩增khp53基因编码区内277bp的特异片段,来鉴定是否插入了人p53肿瘤抑制基因。1.7阴性对照试验293IQ细胞用MEM培养液制成浓度为1×105个/ml的悬液,以100μl/孔接种于96孔板,同时按10倍系列稀释制备病毒稀释液,并分别感染293IQ细胞,每排前10个孔分别加入100μl同一浓度的病毒稀释液,第11、12孔加入等体积含2%BCS的MEM作为阴性对照。37℃,CO2孵箱中培养10d,倒置显微镜下观察CPE情况,按下述公式计算重组腺病毒的滴度:T=101+d(S-0.5)IU/ml其中d=Log10(稀释倍数)=1,S=从第1次稀释起的阳性比率之和(每个孔的值,阳性为0.1,阴性则为0),2次平行实验得到的滴度值相差应不超过100.7=5,简化后该公式为:T=10S+0.5IU/ml。1.8radh-khp33细胞在细胞水平上的表达复苏、培养Saos-2细胞(不表达p53基因)和A549细胞(表达野生型p53基因),分别铺6cm细胞培养皿(Saos-2细胞铺2个,A549细胞铺1个),重组腺病毒rAdMH-khp53按10MOI感染一个培养皿的Saos-2细胞,10h后,用Trizolreagent按试剂盒提供的方法提取Saos-2(阴性)、Saos-2+rAdMH-khp53及A549(阳性)细胞的总RNA,反转录为cDNA。以各细胞的cDNA为模板,P3和P2为引物,PCR扩增khp53特异片段,同时PCR扩增看家基因GAPDH的特异片段作为内对照,并设空白对照(不加模板扩增)。1.9ge的转移各细胞经8步骤同样处理后,提取细胞的总蛋白,定量。配制15%的聚丙烯酰胺凝胶,进行SDS,在50mA电流下过夜转移至NC膜上。转膜后,在5%BSA的PBS中封闭30min,再进行Westernblot分析,加入1∶500稀释的鼠抗人p53一抗,1∶1000稀释的HRP-人p53二抗,最后在DAB中显色,条带达所需深度时(1～3min),立即用水洗膜,终止显色。2.结果2.1pucm-khp33基因回复突变体的构建以人野生型p53cDNA为模板,通过PCR扩增得到khp53基因,见图1,并克隆到pUCmT载体中,阳性重组子pUCm-khp53经PCR及酶切鉴定后双向测序,与cDNA序列一致,符合预期结果。2.2组子的构成用PCR方法筛选到khp53基因正向插入pDC515(io)的重组子,见图2。提取质粒后用BamHI酶切,电泳可见在线性化穿梭载体条带前产生约为1200bp的条带,见图3,证实载体中插入了两端带有BamHI酶切位点的khp53肿瘤抑制基因编码区片段。2.3rad-kholl-kmp53遗产dnapcr的评估经PCR扩增可见,6个克隆均有277bp条带,阴性对照未扩增出条带,见图4。证明khp53基因存在于重组腺病毒的基因组中。2.4u3000滴度共接种两块96孔板,两块板的S值分别为8.8和8.6,滴度分别为2.00×108和1.26×108IU/ml,均值为1.63×108IU/ml。2.5radh-khp33通过rt-pcr检测ca-pcr检测ca-pcr扩增p33基因表达以各细胞总RNA为模板,P3、P2为引物,RT-PCR结果可见,A549细胞有p53mRNA的表达,Saos-2细胞无p53mRNA的表达,rAdMH-khp53感染的Saos-2细胞10h后有p53mRNA的表达;空白对照未扩出条带。以各细胞的总RNA为模板,看家基因GAPDH的特异引物为引物,经RT-PCR各细胞均扩增出条带;空白对照未扩增出条带,见图5。2.6radh-khp65细胞诱导蛋白印迹Westernblot结果显示,Saos-2细胞总蛋白无p53蛋白印迹,有Actin蛋白印迹;rAdMH-khp53感染的Saos-2细胞10h后总蛋白的p53蛋白印迹非常大,表明其表达量非常高,Actin蛋白印迹大小与Saos-细胞相似;A549细胞总蛋白有p53蛋白印迹,也有Actin蛋白印迹,见图6。表明重组腺病毒rAdMH-khp53非常高效地表达了p53蛋白。3.admadh-khp33的基本特点1979年,Linzer等首先发现细胞内有一种蛋白质(p53)能与SV40转染细胞特异性地高亲和力结合。由于它能联合SV40产生大量的T抗原,因此一开始将其归类于肿瘤抗原。1991年,Levine等通过研究,发现转染了myc或ras癌基因的细胞中,若存在野生型p53基因,则出现生长抑制,就此提出p53基因属于抑癌基因。p53基因突变是许多肿瘤发生的重要原因之一。基因突变主要包括点突变、等位基因的缺失、基因重排、与肿瘤病毒癌蛋白结合而失活等。在多种人类肿瘤,如食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、结肠及直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、骨肉瘤、横纹肌肉瘤中均存在p53基因突变,其中在黑色素瘤(原发)中,p53基因突变率高达97%。P53基因突变的肿瘤常表现为侵袭性增强、预后差、转移率高和5年生存率下降,并且更容易产生化疗药物耐受和放疗不敏感。腺病毒载体作为外源性DNA转入真核细胞的工具,具有许多优点:载体容量较大(7.5kb以上),转染效率极高(体外转染人肿瘤细胞可达100%),生产效率高(病毒可在生产细胞上几百倍地扩增),非整合性感染细胞,无遗传毒性,感染能力强(分裂、非分裂细胞均可被感染),外源基因表达量高。这些特点使腺病毒特别适合于肿瘤的基因治疗及其制品的工业化生产。人们很早就开始了重组人p53腺病毒治疗肿瘤的研究。研究表明,当一个人的正常细胞由于体内外各种因素致使其基因发生变化,最后导致肿瘤细胞的产生时,已经积累了10000多个基因水平的改变(如抑癌基因的缺失、点突变、甲基化,原癌基因的重排、扩增、突变等等),而肿瘤抑制基因p53的作用不是单一位点作用,如p53蛋白作为转录因子,直接与特异的DNA序列作用,可以调控下游多种基因的表达。基因芯片研究发现,p53转录激活从而表达上调的有107种基因,转录抑制导致表达下调的有54种基因;同时,p53蛋白本身也能与多个胞内蛋白相互作用,如癌基因mdm2的基因表达产物就可与p53蛋白特异地结合,而抑制p53的功能。因此,相对于肿瘤细胞中的众多基因改变,作为基因替代疗法的重组人p53腺病毒基因药物制剂在感染肿瘤细胞并表达后,如果p53蛋白的表达量不高,则很难确切有效地控制肿瘤生长。但是,由于p53基因的表达同时有一定的细胞毒性,因此若在细胞中的高水平表达将导致重组腺病毒难以扩增到高滴度。本研究使用AdMaxTMHi-IQ腺病毒载体系统构建重组腺病毒rAdMH-khp53,在外源khp53基因上游插入目前启动真核基因表达效率最高的鼠巨细胞病毒启动子(MCMV),在转录水平提高基因的表达,并在启动子与khp53基因之间插入一内含子,进一步提高基因转录后m