大肠杆菌质粒的克隆及载体启动子检测

大肠杆菌质粒的克隆及载体启动子检测

枯草杆菌是研究最广泛的原核生物之一，在微生物遗传研究和工业应用中发挥着重要作用。完整的染色体序列以及30%的基因功能的确定,使枯草杆菌成为研究革兰氏阳性菌遗传学和基因工程的模式菌。枯草杆菌的自然感受态特性使它成为最适宜的基因工程宿主菌之一。在枯草杆菌的基因工程操作中,质粒载体都不是来自于其自身,它们基本都来自金黄葡萄球菌、乳球菌等其他革兰氏阳性菌。而质粒的不稳定性是影响这一系统的最大障碍。质粒的不稳定性主要源于他们的滚环复制类型,在复制过程中产生的单链DNA影响质粒的稳定遗传。特别是来自金黄葡萄球菌的pE194和pC194等质粒在枯草杆菌中无负链复制起始功能,因而在复制过程中会产生大量的单链DNA,造成单链DNA的积累,引起质粒的不稳定。此外,质粒的大小也是影响稳定遗传的因素之一,12kb被认为是质粒稳定的上限;和大肠杆1.1材料表面1.1.1菌株和质粒大肠杆菌E.coliDH5α,由本实验室保存;枯草杆菌(B.subtilis)DB104购自中国典型培养物保藏中心(CTCC);B.subtilis原养型菌株1A747,B.subtilis质粒pGDV1,E.coli质粒pDL由BGSC(俄亥俄州立大学杆菌保藏中心)惠赠。大肠杆菌质粒载体pUC18和pBluskm由本实验室保存;质粒pHB201由Bron博士惠赠。1.1.2dna回收及测量方法限制性内切酶、T4DNA连接酶、牛小肠碱性磷酸酶和基因组提取试剂盒购自promega公司;TaqDNA聚合酶、dNTP、蛋白分子量标准(ASM0431)购自MBI公司;DNA回收试剂盒,质粒小量提取试剂盒购自OMEGA公司;分析纯邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG,cat#N1127),抗生素购自sigma公司。1.1.3pcr索引引物见表1。测序引物为T7和T3启动子引物。PCR引物由北京奥科生物技术公司合成。DNA克隆片段在上海华大基因公司测定序列。1.2方法1.2.1经皮样品,在样品中分离参考文献,稍作调整:挑取单菌落,在生长培养基LBSP(胰蛋白胨1%;酵母提取物0.5%;NaCl1%;蔗糖250mmol/L;磷酸盐450mmol/L,pH7.2)中过夜培养,以1∶50比例,37℃扩大培养2～3h至OD600约1.0。冰浴10min。离心集菌(5000g,10min,4℃),弃上清。用洗液SHMG(蔗糖250mmol/L;Hepes1mmol/L;MgCl20.5mmol/L;甘油10%,pH7.0),反复洗涤沉淀4次(5000g,10min,4℃)。最后用SHMG重悬沉淀并稀释至2mL,以100μL每管分装至洁净的1.5mL的EP管中。用Eppendorf电转仪转化(0.2mm的电转杯,2500V,5ms)。在1mL的LBSPG(LBSP加甘油10%)中37℃摇床上恢复培养1h,涂板过夜培养。1.2.2中间载体pe3的扩增以大肠杆菌质粒载体pUC18为模板扩增了700bp的pMB1复制子(引物ORI-1和ORI-2),在扩增片段的5′端引入限制性内切酶识别位点ApaI,3′端引入限制性内切酶BglII和KpnI的识别序列。将该扩增片段克隆到pBluskm的ApaI和KpnI位点间,得到中间载体pE3。以革兰氏阳性菌质粒pGDV1为模板,用引物pGDV1-1-up和pGDV1-1-down扩增了2.5kb的片段。在其5′端和3′端分别引入BamHI和SacI位点。BglII和SacI消化中间载体pE3,回收700bp的大肠杆菌质粒复制子片段,与BamHI和SacI消化的扩增片段连接转化,得到穿梭载体pGJ103。用BamHI和SacI消化质粒pDL,回收2.2kb的革兰氏阳性菌热稳定性β-半乳糖苷酶基因(bga),克隆到pGJ103构建启动子检测载体pGJ199,以pHB201为模板扩增350bp的P59启动子片段(引物为P59-up和P59-down),克隆至pGJ199得到P59启动子检测载体pGJ201。1.2.3细菌分离和鉴定方法参照文献等,以培养基为空白对照,适当倍数稀释的菌液用分光光度计测定595nm处的吸光值OD595;取2mL待测菌液10000g,4℃离心1min,用2mL的ZBuffer(60mmol/LNa2HPO4·7H2O,40mmol/LNaH2PO4,10mmol/LKCl,1mmol/LMgSO4·7H2O,50mmol/Lβ-巯基乙醇,pH7.0)重悬沉淀。取200μL重悬液,加入1.4mLZBuffer、TritonX-100(10%,V/V)和溶菌酶(10mg/mL)各20μL。混匀,37℃温育30min裂解细菌,加入4mg/mL的ONPG400μL。55℃反应15min,加入1mol/L的Na2CO31mL终止反应。反应液10000g,4℃离心3min,取上清测定420nm处吸光值OD420。酶活值为1000×OD420/OD595×15即66.7×OD420/OD595MillU(密勒单位)2结果与分析2.1扩增中间载体pgdv1和bamhi、saci及耐药基因片段的扩增以大肠杆菌质粒载体pUC18为模板扩增了700bp的pMB1复制子,将该扩增片段克隆到pBluskm的相应位点间,得到中间载体pE3,酶切鉴定结果正确(图1)。在pE3中复制子片段的3′端留有BglII和KpnI位点,在5′端有12个常用的单一限制性内切酶识别位点,是一个极为方便灵活的中间载体。以革兰氏阳性菌质粒pGDV1为模板扩增了2.5kb的片段。该片段含有革兰氏阳性菌质粒的正链和负链复制子以及在大肠杆菌和枯草杆菌中有功能的氯霉素抗性基因,在其5′端和3′端分别引入BamHI和SacI位点。BglII和SacI消化中间载体pE3,回收大肠杆菌质粒复制子片段,与BamHI和SacI消化的扩增片段连接转化,在含氯霉素的固体培养基上筛选得到穿梭载体pGJ103,酶切鉴定正确(图1)。表明扩增的700bp的复制子和氯霉素抗性基因在E.coliDH5α中具有完全的复制功能。将穿梭载体pGJ103电转化至B.subtilis1A747和DB104,在含氯霉素的转化板上分别挑取单菌落培养,提取质粒酶切鉴定均正确(图1),结果表明构建的穿梭载体pGJ103在枯草杆菌中能正常复制。2.2对外源dna片段的克隆为了确定构建的穿梭载体在枯草杆菌中的遗传稳定性,把pGJ103转化到B.subtilis1A747,分别在含氯霉素和不含氯霉素的LB培养基中进行培养试验。结果显示在含氯霉素的LB培养基中48h内未发现明显的结构不稳定和遗传不稳定;在不含氯霉素的LB培养基中,培养18h内无明显的结构不稳定和遗传不稳定现象,酶切鉴定显示无结构不稳定现象(图2)。36h培养,质粒发生降解现象(图3)。分别用来自枯草杆菌生物素操纵元的2.4kb,4kb,4.4kb和5kb的片段来验证pGJ103对外源DNA片段的克隆能力。实验中3kb以下的片段克隆操作很方便;与较小片段相比,4kb和5kb的2个片段连接效率较低,转化板的克隆子个数减少,但挑取的克隆子酶切鉴定正确。将克隆了不同大小片段的穿梭载体转化B.subtilis1A747,挑取克隆子过夜培养,抽提质粒鉴定,结果正确(图4)。这说明该穿梭载体对大小不同的DNA片段均具有很好的承载能力。2.3启动子检测载体为了验证启动子检测载体功能,将扩增的P59启动子片段,克隆至启动子检测载体pGJ199,得到pGJ201。检测组成型启动子P59的转录强度,含pGJ201的B.subtilis1A747培养24h,胞内β-半乳糖苷酶酶活性达到500mU。3带格朗日系的枯草杆菌端基因型聚合体的构建枯草杆菌的分子克隆操作通常效率较低。影响克隆效率的因素主要是两方面—转化效率和质粒在宿主中的稳定性。因此,构建一个方便而稳定的穿梭载体是目前最好的解决办法。本实验室构建的穿梭载体PGJ199,在复制子的5′端带有十多个常用的单一酶切位点,这些酶切位点与大肠杆菌复制功能区和枯草杆菌的正负链复制功能区相互独立,可以方便地进行克隆构建。而且,常用的枯草杆菌质粒一般缺乏负链复制功能,在我们的试验中选择了在枯草杆菌具有正负链复制功能的质粒pGDV1,PCR扩增了正负链复制子,与中间载体pE3的大肠杆菌复制子和多克隆位点连接构建了仅3.2kb的大肠杆菌-枯草杆菌小型穿梭载体,具有较好的稳定性和承载能力。构建的穿梭载体pGJ103为我们实验室的功能基因的表达以及鸟枪法克隆启动子片段工作提供了一个方便快捷可靠的克隆工具。在整个穿梭载体的构建过程中,pE3的构建有一定难度,为了在复制子的5′端留有充足的酶切位点,选择