1-2moll甜菜碱对水稻高gc含量dna序列的增强效果

1-2moll甜菜碱对水稻高gc含量dna序列的增强效果

水稻是人类最重要的粮食之一。随着地球人口日益增长,人们对于粮食需求也日益增高,因此研究水稻增产、抗病、抗旱等各个领域均具有重要意义。自1988年以来,科学家发明了聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)技术1材料和方法1.1dna聚合酶和保真剂实验中水稻品种为日本晴野生型水稻;FastpfuDNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司;TaqDNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司;Phusion超保真DNA聚合酶和Q5高保真DNA聚合酶购自NewEnglandBiolabs(NEB)公司;甜菜碱(Betaine)、二甲基亚砜(DMSO)和甘油(Glycerin)试剂均购自Sigma-Aldrich公司;快捷型植物基因组DNA提取系统试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。1.2方法1.2.1水稻dna的提取利用快捷型植物基因组DNA提取系统试剂盒来提取水稻叶片基因组DNA作为PCR模板。利用NanoDrop2000分光光度计测定DNA浓度。1.2.2水稻基因片段locos0102本实验挑选了3个高GC含量的水稻基因片段:LOC_Os08g06050(部分序列,片段大小为399bp,GC含量75.4%)、LOC_Os01g01019(部分序列,片段大小为1016bp,GC含量64.2%)和LOC_Os01g11080(部分序列,片段大小为1034bp,GC含量73.9%),并设计引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。水稻基因片段LOC_Os08g06050引物序列为:正向引物AGCGGAAACCTGGGCGAGTTGTC,反向引物CCGACGAGACGTCGTCGCGC;水稻基因片段LOC_Os01g01019引物序列为:正向引物AGGACGTTGACAGGTGCTGGAG,反向引物ACTGCTCAACCGCATGCCCATG;水稻基因片段LOC_Os01g11080引物序列为:正向引物ATGGGCCACGCATCCACCGACC,反向引物TCTCCGGCGAGCTCACTCACCAC。1.2.3pcr扩增dntpfici数据TaqDNA聚合酶反应体系(50μL)包括5μL10×Taq缓冲液(MgPhusion超保真DNA聚合酶反应体系(50μL)包括10μL5×PhusionHF缓冲液,4μL2.5mmol/LdNTPMixture,2μL50mmol/LMgClQ5高保真DNA聚合酶反应体系(50μL)包括10μL5×Q5反应缓冲液,4μL2.5mmol/LdNTPMixture,2μL50mmol/LMgClFastpfuDNA聚合酶反应体系(50μL)包括10μL5×Fastpfu缓冲液,4μL2.5mmol/LdNTPMixture,2μL50mmol/LMgCl以上PCR反应均进行两次重复实验。1.2.4y49s-3型凝胶的成像分析取PCR产物,用1%的琼脂糖凝胶进行电泳,电泳后用JY04S-3C型凝胶成像分析系统(北京君意东方电泳设备有限公司)进行扫描成像,并用ImageJ软件分析PCR产物条带灰度值,通过Excel软件统计汇总并做图表分析。2结果2.1甜菜碱浓度对locos0102基因片段的增塑作用以水稻DNA为模板,用TaqDNA聚合酶对3个高GC含量的水稻基因片段LOC_Os08g06050(GC含量75.4%)、LOC_Os01g01019(GC含量64.2%)和LOC_Os01g11080(GC含量73.9%)进行PCR扩增,在反应体系中分别加入终浓度为0、0.25mol/L、0.5mol/L、0.75mol/L、1.0mol/L、1.25mol/L、1.5mol/L、1.75mol/L、2.0mol/L、2.25mol/L、2.5mol/L和2.75mol/L的甜菜碱。在扩增LOC_Os01g11080基因片段时,甜菜碱浓度在1-2.25mol/L时对于PCR扩增具有明显的增强效果;在扩增LOC_Os01g01019基因片段时,甜菜碱浓度在0.75-2mol/L时对于PCR扩增具有明显的增强效果;在扩增LOC_Os08g06050基因片段时,甜菜碱浓度在0.75-2mol/L时对于PCR扩增具有明显的增强效果(图1)。分析本实验中3个高GC含量的水稻基因片段的扩增情况,发现甜菜碱浓度在1-2mol/L时能够明显提高扩增产量和产物特异性。2.2不同增强剂对于水稻高gc的pcr检测在利用TaqDNA聚合酶对3个高GC含量的水稻基因片段LOC_Os08g06050(GC含量75.4%)、LOC_Os01g01019(GC含量64.2%)和LOC_Os01g11080(GC含量73.9%)进行PCR扩增时,分别添加了浓度梯度为0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%及20%的甘油和浓度梯度为0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%及20%的二甲基亚砜。在扩增LOC_Os01g11080基因片段时,7.5%-15%的甘油以及7.5%-12.5%的二甲基亚砜表现出明显的增强效果;在扩增LOC_Os01g01019基因片段时,7.5%-10%的甘油以及5%-10%的二甲基亚砜表现出明显的增强效果;在扩增LOC_Os08g06050基因片段时,7.5%-10%的甘油以及5%-10%的二甲基亚砜表现出明显的增强效果(图2)。综合分析图2中3个基因片段的扩增结果,发现二甲基亚砜浓度在7.5%-10%时,甘油浓度在7.5%-10%时表现出了最明显的增强效果。为了比较不同增强剂对PCR反应的增强效果,选择了10%的甘油和10%的二甲基亚砜与甜菜碱进行平行比较。在利用TaqDNA聚合酶对3个高GC含量的水稻基因片段LOC_Os08g06050、LOC_Os01g01019和LOC_Os01g11080进行PCR扩增时,分别添加了终浓度为10%二甲基亚砜、终浓度为10%的甘油以及终浓度为1.5mol/L的甜菜碱。实验结果(图3)显示虽然二甲基亚砜和甘油能够促进水稻高GC含量片段的扩增,但是促进效果都没有甜菜碱明显。2.3locos010g2009基因片段的pcr扩增为了验证甜菜碱是否对于不同的DNA聚合酶催化的水稻高GC含量DNA序列的PCR反应均有增强作用,分别用TaqDNA聚合酶、Phusion超保真DNA聚合酶、Q5高保真DNA聚合酶以及FastpfuDNA聚合酶对LOC_Os01g01019基因片段进行PCR扩增,并向各个反应体系中加入终浓度均为1.5mol/L的甜菜碱。结果(图4)表明,对于这几种DNA聚合酶,甜菜碱都起到了不同程度促进效果,不仅提高了PCR产量,而且增强了产物特异性。3增加甜菜碱对水稻高gc含量dna序列pcr的影响水稻的基因组序列富含高GC含量的序列。高GC含量DNA序列形成的二级结构比较稳定,使得DNA模板变性会很困难,同时在退火时引物与模板结合受阻,容易形成错配从而导致扩增效率很低或者扩增失败在PCR反应体系中加入甜菜碱能够削弱二级结构的影响,促进PCR反应的进行此外,除了甜菜碱还有如二甲基亚砜、甘油等多种PCR增强剂都可以削弱高GC含量DNA序列二级结构的影响。通过比较10%二甲基亚砜、10%甘油和终浓度1.5mol/L的甜菜碱发现对于水稻的高GC含量DNA序列的PCR扩增,甜菜碱的增强效果最为明显。有研究表明,将不同的PCR增强剂相互混合也可以有效地增强高GC含量基因序列的PCR扩增效果目前,市面上的DNA聚合酶种类比较丰富,不同的DNA聚合酶对于水稻高GC含量DNA序列的扩增结果也不相同。在不加入甜菜碱时,TaqDNA聚合酶和Phusion超保真DNA聚合酶均对LOC_Os01g01019基因片段扩增失败,Q5高保真DNA聚合酶和FastpfuDNA聚合酶虽然能在一定程度上扩增得到目的片段,可是扩增特异性明显降低。加入甜菜碱之后,对于4种DNA聚合酶