表面活性剂协同发酵谷氨酸工艺的研究

表面活性剂协同发酵谷氨酸工艺的研究

2004年，中国的粮氨酸钠（味精）产量超过100万吨，达到世界第一。味精生产企业正向大型化、集约化发展,生产水平不断提高,但是与一些西方国家比较,我国的生产效率还有待更进一步的提高,生产成本也急需更进一步的下降,因此提高谷氨酸发酵产酸率是一个亟待解决的问题。表面活性剂是在加入很少量时既能大大降低溶剂的表面(界面)张力的一大类有机化合物国内外的研究表明,将表面活性剂作为发酵促进剂的研究越来越多,主要应用在以发酵法生产酶制剂大多数专家认为由于表面活性剂独特的结构特征,使其具有增加细菌细胞膜通透性的作用,从而使代谢产物分泌到细胞外,消除了代谢产物的负反馈作用,完成产物在发酵液中的蓄积,最终达到了提高产率的目的。基于以上原理,为了使谷氨酸生产产率进一步提高,本文选择了几种新型的表面活性剂与传统的表面活性剂作为谷氨酸发酵促进剂作比较,在摇瓶条件下研究了各种表面活性剂对细菌生长及其谷氨酸在细胞外累积的影响,同时亦为表面活性剂作为发酵促进剂的原理研究提供有效的数据支持。1材料和方法1.1主要材料和设备1.1.1蘑菇谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)T-613,广州市微生物研究所保存菌种。1.1.2试剂、实验产品十二烷基硫酸钠(SDS)、吐温60(Tween-60)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、正丁醇(Butanol)、异丙醇(Isopropanol)、二甲基亚砜(DMSO)均为市售分析纯化学试剂;芹菜素硬脂酸酯(PGS),溴化五甲基二乙撑基三硬脂基三铵(3-RdienQ)、聚氧乙烯基失水山梨醇单脂肪酸酯三季铵盐(CTTE)、N,N,N’-五甲基二乙烯三聚氧乙烯硬脂酸酯(MDTPS)为本实验室自行合成;二甲基-乙基-甜菜碱(DEBT)为广州慧源绿色生物化工有限公司提供(编号为企业产品代号)。可见分光光度计(Spectrumlab22PC):上海棱光技术有限公司;生化培养箱(DGG-9070B型):上海森信实验仪器有限公司;新型恒温振荡器(ZHWY-21020C):上海智城分析仪器制造有限公司;超净化工作台(ZHJY-1214B):上海智城分析仪器制造有限公司;超声波超微粉碎机(Scientz-08):常州诺基仪器有限公司。1.1.3培养基及溶液配制斜面培养基:蛋白胨1.0%,牛肉膏1.0%,氯化钠0.5%,琼脂2.0%,pH值7.0;32℃恒温培养12~16h,保存于4℃冰箱待用。种子培养基:葡萄糖3.0%,玉米浆1.0%,尿素0.5%(分消),磷酸氢二钾0.1%,七水硫酸镁0.04%,七水硫酸亚铁2×10发酵培养基:葡萄糖13.0%,玉米浆0.6%,初始培养基尿素0.6%(分消),三水磷酸氢二钠0.7%,七水硫酸镁0.06%,氯化钾0.05%,七水硫酸亚铁2×10表面活性剂溶液的配制:将SDS、Tween-60、DEBT均配制为质量分数为10.0%的溶液待用;将CTAB、PGS、3-RdienQ、CTTE、MDTPS均配置为质量分数为0.5%的溶液待用。1.2分析1.2.1测定氨基酸含量茚三酮比色法1.2.2待测细胞的制备超声波细胞破碎法:取一定量的发酵液置于离心管中,在10000r/min高速离心10min,蒸馏水清洗细胞2次,得到待测细胞;利用超声波细胞破碎仪,破碎30min,滤去菌体,得到上层清液,按照上述茚三酮比色法测量。1.2.3检测细菌的生长量将发酵液稀释10倍使用分光光度计在650nm处测定吸光度OD1.2.4测定残糖量采用费林试剂法。1.2.5ph测试使用精密pH试纸检测。2结果与分析2.1菌种产酸率的确定冻干菌种经活化培养后,筛选产酸率高且产酸比较稳定的菌株,接保藏斜面保藏于4℃冰箱中,待用。为了更好确定加入表面活性剂的时间和剂量,研究了本菌种的基本发酵特性如图1,图2所示。由图1知,随着发酵时间的推移,由于菌种对尿素的利用和谷氨酸的产生,使发酵体系的pH下降,当pH下降到7.0以下时,及时向体系中补充一定量的尿素,一方面为菌种生长与产酸提供所必需的氮源,另一方面尿素被菌种利用时所产生的NH从图2可知,本菌种的适应期一般为2~3h,由于种子培养基、发酵培养基成分基本相同,因此适应期比较短;对数生长期在10~20h;稳定期为20~40h;产酸期为16~48h。在没有添加表面活性剂的情况下,菌种产酸率基本稳定在3.0%左右。本实验选用菌种产酸率较目前生产菌种的产酸率相差较大,是因为本文属于基础研究范畴,实验选用发酵法生产谷氨酸的原始菌种,此菌种是从土壤中直接分离纯化而得,并未进行定向诱变育种。另外取得高产菌种实属不易,对于企业而言,生产菌种为技术核心,具有高度的机密性,索取此类高产生产菌种不易;对于拥有高产菌种的高校和研究机构,其研究成果有较高的经济价值,亦不轻易外传。但是基础研究表明生产谷氨酸的菌种都属于细菌,细胞结构和代谢循环基本一致,产酸机理也相差无几,因此可以认为在选用原始菌种的发酵体系中,根据有无使用表面活性剂的对比实验数据——产酸率所提高的相对比率可较好反映表面活性剂作为谷氨酸发酵促进剂的功效性,对谷氨酸发酵工业生产具很大的参考价值。2.2阳离子表面活性剂的杀菌效果本实验选择了8种表面活性剂和三种常用有机溶剂分别为SDS、Tween-60、DEBT、CTAB、PGS、3-RdienQ、CTTE、MDTPS、Butanol、Isopropanol、DMSO。由于各种表面活性剂的性质各异,对微生物的毒性也不同,因此在添加剂量与加入时间上亦存在差异。一般来说阳离子表面活性剂对生物的毒性较大,非离子表面活性剂毒性小,对生物的生长影响较弱,阴离子表面活性剂的毒性和杀菌力介于两者之间由表1可见,除了SDS、Butanol外,其他7种表面活性剂和2种溶剂在特定的加入剂量和加入时间对该菌种产酸率有一定程度的提高,这可能是因为SDS所带负电抑制谷氨酸的分泌;Butanol效果不佳的原因在于其杀菌能力较强,菌种对其较为敏感。对于毒性较大的阳离子表面活性剂3-RdienQ加入剂量要少且加入时间在产酸期,否则会抑制产酸;对于毒性较小的非离子和两性表面活性剂加入剂量在体积分数为0.1%~1.0%较为有效,加入时间在菌种生长的对数期较为有效;对于作为非离子表面活性剂的PGS情况特殊,该菌种对其比较敏感,加入剂量要控制在体积分数为0.01%~0.1%,加入时间在产酸期。综合比较认为CTTE与DMSO的效果相对较好,可将产酸率分别提高26.13%和22.22%。2.3不同体积分数的ctte表面活性剂对产酸率的影响在发酵培养基中分别加入不同质量分数的CTTE与DMSO,CTTE加入时间为4h,DMSO加入时间为16h,最终测定各个样品的产酸率和OD从图3可知,当加入CTTE表面活性剂的体积分数在0~0.16%之间时,谷氨酸发酵的产酸率均较空白实验有一定程度的提高,其中当加入体积分数达到0.08%时,谷氨酸的产量达到最大值6.15%,比对照实验产率提高了28.39%;同时从最终OD从图4可知,当加入DMSO的体积分数在0~0.16%之间,谷氨酸发酵的产酸率均较空白实验有一定程度的提高,其中当加入体积分数达到0.10%时,谷氨酸的产量达到最大值6.09%,比对照实验产率提高了25.57%;同时从最终OD2.4最佳剂量确定因为表面活性剂具有改变细胞膜通透性和杀菌作用,不同的加入时间直接影响细菌的生长代谢。因此通过改变表面活性剂的加入时间,寻找最佳的加入时间对发酵产酸具有重要的意义,结果如图5、图6所示。实验中表面活性剂的添加剂量为上述实验所得到的最佳剂量,即CTTE添加体积分数为0.08%,DMSO添加体积分数为0.10%。从图5可知,将CTTE在发酵菌种的生长对数期加入或者是在产酸期后期加入,即0~6h或者20h以后加入对发酵产酸率有一定程度的抑制作用,特别是在发酵前期0h~6h加入,产酸率明显降低,同时菌种的OD从图6可知,DMSO表面活性剂在发酵菌种的生长对数期加入对发酵产酸率有一定的促进作用,特别是在发酵5~10h加入,产酸率达到了最大值6.21%,较空白实验的产酸率提高了23.95%。而从最终OD2.5ctte与dmso协同使用对产酸率的影响由于CTTE与DMSO各有利弊,前者可以较大程度提高产酸率,但是发酵周期相对较长,同时前者的加入对于菌种的生长有一定程度的影响;后者的加入对于菌种的生长没有很大的影响,并且产酸率有一定程度的提高,并且它可以缩短发酵的周期,因此考虑将两种表面活性剂协同使用,发挥各自的优势,彼此掩盖对方的不足,进一步提高谷氨酸的发酵产率。为了得到CTTE与DMSO的协同效果,设计正交试验表L从表3可知,A因素的三个水平的优劣顺序为K验证正交实验得到的最佳工艺条件,按照优化工艺参数进行新一批发酵,设置空白实验与之相比较,实验结果如图7所示。从产酸率曲线可看出,在加入MDSO和CTTE之后,菌种产酸的初始时间提前了4h,并且产酸的速率也较空白实验有所提高。当空白实验在发酵44h后,达到产酸率最大值4.8%,而发酵36h后有表面活性剂的体系产酸率达到最大值6.55%,残糖质量分数也下降到了1.0%以下,其产酸率提高了36.46%;产酸率达到最大值后继续发酵,则产酸率有所下降,主要是因为菌种对谷氨酸有一定的利用能力。从最终OD2.6产品的发酵效率加入MDSO和CTTE后,细胞膜中脂肪酸的比例发生了变化,使菌体细胞膜的通透性增大,更加有利于谷氨酸向细胞外分泌,从而减小了产物对于菌体代谢的负反馈作用,提高了谷氨酸的转化效率,从而达到了缩短发酵周期的目的,有效地提高了生产效率。从图7可知,在加入MDSO和CTTE的发酵条件下,谷氨酸的发酵达到产酸最大值的时间较空白实验分别提前了8h,即发酵周期从原来的44h缩短为36h。因此在两种表面活性剂联合使用时,可以缩短发酵周期,降低发酵的能量消耗,很大程度的提高了生产的效率,降低了生产的成本。2.7表面活性剂促进有关酵母菌种染色的情况由于表面活性剂具有特殊的化学结构,即亲水基团和疏水基团,当溶液体系中的表面活性剂浓度达到其临界胶束浓度之后,会表现出一些特殊界面性质,其中有一个就是可以与某些色素结合起来,形成一个聚集体。另外在微生物学中的染色方面,革兰氏染色和实验室简易染色被广为使用,并且得知微生物活体细胞染色较为困难,一般在染色以前都是将其固定在载玻片上,从而进行观察。倘若表面活性剂与细胞表面结合或者是沉积,则通过对活体的染色可以在显微镜下观察得到。由图8可以观察到:发酵体系在加入表面活性剂之前,对于T-613活体细胞很难染色,菌体本身仍然透明,并且可以清楚观察少数菌体已经两两成对,呈八字形,这是即将进入产酸期的一个特征。由图9可以观察到:一半以上的菌体已经可以被染成蓝色,仍然存在一少部分菌体没有被染色,这一现象说明在表面活性剂加入后,在菌体表面进行了沉积和结合,从而是活体细菌可以进行染色,另外一部分没有被染色是因为沉积的浓度还没有达到表面活性剂的临界胶束浓度。不排除有菌种死亡的情况,但是不可能被染色的全部死亡,因为菌种的产酸率还在不断的提高,未被染色的菌种比例不可能发酵产生大量的谷氨酸。由图10可以观察到:全部的菌体已经可以被染成蓝色,这一现象说明在表面活性剂加入后,在菌体表面进行了沉积和结合,改变了细胞的通透性,从而是活体细菌可以进行染色,并且此时由于表面活性剂的加入,或多或少会对菌种的生长造成影响,并且可能杀死一部分菌种,因此会在稳定期较大增加菌种的死亡率,提前进入衰亡期,这也是发酵周期缩短的一个重要原因。3表面活性剂加入对氨基酸发酵的影响3.1通过对MDSO和CTTE的加入时间和加入剂量的单因素实验分析可知,MDSO表面活性剂在菌种生长对数期8h加入体积分数为0.08%,则可以将谷氨酸发酵的产酸率提高24.14%,而在产酸初期20h加入体积分数为0.10%的CTTE,可以将谷氨酸发酵产酸率提高23.95%,可见两种表面活性剂作为谷氨酸发酵促进剂的有显著效果的。3.2研究了两种表面活性剂同时加入的协同效果,研究结果表明:菌种生长对数期(10h)