酶促法合成维生素e琥珀酸酯

酶促法合成维生素e琥珀酸酯

维生素e酯类维生素e，也被称为发芽酚，包括四种类型：-质子、-质子、-质子和-质子。维生素E是人类生命活动中不可缺少的维生素,也是一种重要的抗氧化剂,广泛应用于医药、食品添加剂、化妆品等多个领域。但是维生素E性质很不稳定,易被空气氧化失去生物活性,这给维生素E产品的制备、贮存等带来许多不便目前维生素E酯主要由化学法合成。一般使用三乙胺、吡啶或酸碱作催化剂,环境污染大,反应温度较高与化学合成法相比,酶法合成具有反应条件温和、催化效率高、催化专一性强等优点。Torres等1材料和方法1.1素e表现为维生素E琥珀酸酯(α-生育酚琥珀酸单酯,文中统称维生素E琥珀酸酯),纯度99.9%,购于sigma公司。维生素E(α-生育酚),纯度97%,购于AlfaAesar公司。Novozym435(树脂固定化1.2学生犯罪率测定高效液相色谱仪,日本岛津公司LC-20A(配SPD-M20A二极管阵列检测器)。三用紫外分析仪(WFH-203),上海精科实业有限公司。1.3脂肪酶法合成维生素e往50ml具塞锥形瓶中加入5ml叔丁醇和DMSO混合溶剂,适量的维生素E和琥珀酸酐,待两底物完全溶解后,加入适量脂肪酶,盖好瓶塞,置于转速为200r·min1.4品质测定采用橄榄油乳化液水解滴定法测定1.5修饰液的配制称取修饰剂琥珀酸酐溶于二甲基亚砜中,配制成一定浓度的修饰液。将已知质量的Novozym435浸泡于pH8.0的磷酸缓冲液(0.02mol·L1.6检测条件确定维生素E琥珀酸酯定性分析采用薄层分析与HPLC相结合;定量分析为HPLC法。薄层分析法:自制硅胶板(GF254),展开剂为正己烷∶乙酸乙酯∶冰醋酸(体积比)=8∶1.5∶0.5,采用色谱纯甲醇配制维生素E标准品、维生素E琥珀酸酯标准品、反应物样品,分别在硅胶板上点样,待各样充分展开后,取出层析板,晾干。在254nm紫外灯下观察实验结果。发现反应物样品与维生素E琥珀酸酯标准品在同一位置出点,并且未见其他杂点,判断反应物中有维生素E琥珀酸酯的生成。HPLC分析条件:配制维生素E和维生素E琥珀酸酯的甲醇溶液,进行全波长扫描,确定各自的最大吸收波长(分别为292nm和285nm)。色谱柱为AkasilC2结果与讨论2.1根霉脂肪酶分别以根霉脂肪酶(2.2e表现为表面活性剂有机介质性质是有机相酶促反应的重要因素,有机溶剂可夺走吸附在酶分子表面的必需水,破坏酶的活性构象,而且影响反应体系中传质速率维生素E琥珀酸酯在DMSO中有较高的产率,但极性很强的DMSO容易夺取酶分子表面的水并争夺蛋白质结构内部的氢键,导致蛋白质变性,使其催化活性降低2.3羧酸衍生物常用的酰基供体有羧酸、羧酸酯(包括羧酸乙烯酯和羧酸烷基酯)以及其他一些羧酸衍生物等。文献报道乙烯酯作为酰基供体比烷基酯发生酯交换反应速度高20～100倍,因为乙烯酯作为酰基供体反应过程中生成的是乙烯醇,会异构为低沸点的乙醛而极易除去,从而促使平衡向酯生成的方向移动2.4反应温度对反应的影响温度是影响酶催化作用的主要因素之一。一方面,随着温度的升高,反应速度加快;另一方面,酶是生物大分子,过高的温度会引起酶的变性失活。而且本反应中底物维生素E化学性质极不稳定,过高的反应温度会导致其降解变性,影响最终反应产率。将0.43g维生素E和0.60g琥珀酸酐(即摩尔比改为1∶6)溶于5mlDMSO与叔丁醇混合溶剂(两者体积比为3∶2)中,加入0.02g假丝酵母脂肪酶(随着反应温度的升高,反应速度逐渐加快,最终的维生素E琥珀酸酯产率升高。但反应温度超过30℃后,随温度的升高,反应最终产率相差不大。而且实验证实,温度超过40℃维生素E有明显的降解变性发生;高温反应可能造成维生素E琥珀酸酯颜色深,品质差2.5响应面实验设计响应面分析(responsesurfacemethodology,RSM)是数学和统计学相结合的产物,采用多元二次回归方法作为函数估计的工具,用于酶促反应实验的设计与分析,具有实验周期短、求得的回归方程精度高、能快速有效得到反应最优条件等优点。根据单因素实验结果,在固定其他反应条件的前提下[反应温度30℃,反应介质为5mlDMSO与叔丁醇混合溶剂(体积比为3∶2),催化剂为0.02g假丝酵母脂肪酶],选定底物摩尔比、底物浓度(以维生素E浓度为准,琥珀酸酐按照摩尔比加入)、反应时间这3个因素作为自变量,以维生素E琥珀酸酯产率为响应值进行响应面实验分析,各因素的水平设计见表3。采用Mintab15软件选用Box-Behnken进行实验设计并以随机顺序进行实验,各实验点设