6种不同极性溶剂提取物对6种常见菌的抑菌性筛选

6种不同极性溶剂提取物对6种常见菌的抑菌性筛选

裸花紫珍珠etarn是马鞭草科的一种植物。在中国，它主要分布在广东、广东和海南。药品的位置是地上的干燥部分。它是海南的大面积隧道医疗材料之一。裸花紫珠全年均可采收,除去杂质,晒干,枝叶有抗菌止血、消炎解毒、祛风祛湿之功效1细菌培养算法裸花紫珠,海南九芝堂药厂提供;白色念珠菌;铜绿假单胞菌;大肠杆菌;金黄色葡萄球菌,肺炎双球菌,枯草芽孢杆菌;临床分离菌株,海南省人民医院检验科惠赠,经实验室传代保藏多次后的菌株。2方法和结果2.1菌株的活化培养准确称取生物样品冻干品9g,装入34ml萃取池中,萃取池底部提前加装纤维素滤片,依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、水为提取溶剂,设定ASE提取参数(提取压力为10MPa,提取温度为45℃,提取时间12min,循环2次)白色念珠菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、铜绿假单胞菌分别接种于NB培养基中(18gNB粉末溶于1L蒸馏水中,分装三角瓶,121℃高压灭菌15min),37℃活化培养1次(第2次的时候,培养一批菌)每次活化培养时间为16h。然后接入至无菌NB培养基中,150r·min对6种菌分别吸取一定浓度的提取药液100μl至放好的的牛津杯中,注意不要将药液溢出牛津杯外,同时吸取相同体积的DMSO和头孢他啶加入准备好的牛津杯中。指示菌在最适生长温度37℃的恒温培养箱中培养24h,记录抑菌圈值。2.1.7反应物的抑菌效果从表3的结果可以看出,不同的提取药液有不同的抑菌效果,但水提药液几乎看不到抑菌圈,其他5种提取药液对不同的菌分别有不同的抑菌效果。除了水提物,其他5种溶剂提取药液对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌都有比较好的抑菌效果,其他4种菌在某一种到两种溶剂提取液中有较好的抑菌效果,乙酸乙酯提取液对多数菌种有中强度的抑菌效果。头孢对每一种菌都有非常好的抑菌圈值,DMSO没有抑菌性或者说抑菌性很弱。2.2ase联合有机溶剂提取法活细胞中的乳酸脱氢酶能将刃天青(蓝色)转化为荧光物质试卤灵(粉红色),试卤灵继续被细胞还原为无荧光的白色物质(白色),无活性或死亡的细胞丧失了代谢能力而不能还原刃天青准确称取50mg的刃天青试剂,使用无菌水溶解,定容到50ml的的容量瓶里,配制成1mg/ml溶液,5°C避光保存备用。准确称取裸花紫珠粉末10g,装入34ml萃取池中,萃取池底部提前加装纤维素滤片,依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇为提取溶剂,设定ASE提取参数(提取压力为10MPa,提取温度为45℃,提取时间12min,循环2次),有机溶剂提取液常温干燥,分别制得裸花紫珠不同的生物活性物质。称取相同质量0.2g活性物质用2ml二甲基亚砜(DMSO)溶解成0.1g/ml,待用。使用纯的DMSO完全溶解后,用一定浓度的DMSO进行对半稀释8个浓度。头孢同样使用无菌水配制成50mg/10mL溶液后。由于在做刃天青实验时发现DMSO在一定浓度下有抑菌作用,且对大肠杆菌作用较弱,所以,需做预实验消除DMSO对本实验的影响。预实验通过增加大肠杆菌菌悬液的体积来稀释DMSO的浓度,达到确定加菌悬液和药液的量的目的。从表4可以看出DMSO在11%以下显示对大肠杆菌没有抑菌性,所以在实验时必须把其调到更低才可以不影响实验。所以,又考虑到直接用提取溶剂做空白对照,再进行溶剂测试预实验。2.2.4.加溶剂对实验的影响从表5可以看出只有乙醇和石油醚可能在加菌量至少为175μl以上及加溶剂为20μl时才不会影响实验,此时溶剂体积浓度为10.2%。综上,DMSO浓度要求稍弱些,所以,在96孔板中按照表6加样。2.2.5悬浮液的制备每组实验重复3次,加样后,用封口膜将96孔板密封并置于37°C自动新型恒温培养箱中培养16h,每小时观察1次颜色变化并记录。2.2.7不同提取药剂抑菌效果检测从图1可以看出第1排为,只加了菌和DMSO的阴性对照,全显示红色(黑白图呈浅灰色),表明DMSO对实验菌没有抑菌效果或者效果很弱,第2排为头孢的阳性对照组,全显蓝色(黑白图呈深色),说明头孢有很好的抑菌效果,3~7为5种提取药液对大肠杆菌的显色结果,可以看出乙醇和正丁醇都有较低的抑菌显色结果,乙酸乙酯和氯仿段没有,石油醚段也有最低抑菌浓度,但比乙醇和正丁醇浓度高。8~12为5种提取药液对枯草芽孢杆菌显色结果,可以看出乙醇和正丁醇也都有较低的抑菌显色结果,乙酸乙酯段抑菌效果较弱,氯仿段提取液几乎没有抑菌效果,石油醚段较高的抑菌浓度显色结果。从表7可以看出乙醇和正丁醇段对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度相对都较小,平均值分别为0.022g·ml3讨论中药消毒剂中的主要活性成分有苯丙素类化合物、醌类化合物黄酮类化合物、疏类和挥发油、三萜及其苷类、生物碱类1.1材料表面1.2主试剂和设备见表1~表2。2.1.1萃取液体2.1.2悬浮液的制备2.1.3培养基的制备在无菌操作台,将肉汤培养基加入琼脂后,溶解均匀,在高压蒸汽灭菌锅中,用0.1MPa压力灭菌20min,并冷却至60℃左右,用移液枪准确量取20ml该培养基,加入内径一致并预先水平放置的培养皿内,凝固后并使培养皿中水份干燥透,待用。2.1.4不同菌株对牛蒡杯的mic实验吸取一定浓度的指示菌菌悬液150μl至制好的平板上,用无菌耙涂布均匀,并用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中,在水平放置的平皿中均匀地放置2只牛津杯,待放入相同药液,作为平行实验,共需要36个平板实验,此外每种菌还需要2只DMSO空白对照,2只头孢阳性对照,所以,再需要做12个平板实验。2.1.56种溶剂提取物溶液的添加