倍半稀释法测定10-hda对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

倍半稀释法测定10-hda对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

10-羟色胺-2-戈齐酸（10-hydro-2-acid），简称10-hda。这是人体中的重要脂肪酸。约50%的天然脂肪体在天然浆中含量约为1.4%2.0%。关于抗菌物质的抑菌机理报道很多,一般认为抑菌剂的主要作用途径是膜攻击、抑制细胞呼吸或者抑制蛋白质的合成等1材料和方法1.1其他试剂的制备金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)为本实验室保藏菌种,其他试剂均为分析纯。DDS-11A电导率仪,上海第二分析仪器厂;紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;DYY-12电泳仪,北京市六一仪器厂;ChampGel5500凝胶成像系统,北京赛智创业科技有限公司;原子力显微镜,德国Bruker公司。1.2测试方法1.2.1菌种培养及培养配制LB液体培养基经121℃灭菌20min后,冷却,接种金黄色葡萄球菌后于37℃、180r/min条件下培养24h。取菌液进行平板划线培养,挑取生长状况较好的单个菌落进行液体培养基扩培。1.2.2lfoxide,dmso液体倍半稀释法:用二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,即DMSO)配制10-HDA倍比稀释液,同时设置无菌水对照组和溶剂对照组(即DMSO对照组)。取对数生长期的金黄色葡萄球菌培养液稀释至1×101.2.3-hda的体外生长取活化后的金黄色葡萄球菌菌种按1%(v/v)接种量分别接种于4个100mLLB培养基中,分别加入等体积的不同浓度的10-HDA,使其终浓度分别为0×MIC(即DMSO对照组)、1×MIC、3×MIC,同时设置无菌水空白对照组,于37℃、180r/min培养,不同时间点取样测OD1.2.4菌株4的离心测定将培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌于5000r/min离心10min,收集菌体。然后用灭菌生理盐水洗涤,重复操作两次,然后用生理盐水调节菌体浓度至101.2.5影响细菌物质含碳量的体积在浓度为101.2.6影响细胞的微结构特征的影响取制备的浓度为101.2.7影响细菌代谢活力的因素取制备的浓度为101.2.8添加dmso后体外生长曲线金黄色葡萄球菌培养至对数生长期,按5%(v/v)接种量分别接种于50mLLB液体培养基中,分为对照组和试验组,试验组加入10-HDA溶液分别使其终浓度为1×MIC、3×MIC,同时设置对照组,加入等体积的DMSO溶剂,继续于37℃、150r/min培养,分别于8h后取样,稀释成相同的吸光度值后取样10mL于5000r/min离心10min。然后用生理盐水洗涤2次,取沉淀加20μL无菌水和20μL上样缓冲液于100℃保温5min,再次离心,取10μL上清液进行SDS凝胶电泳。2结果与分析2.1mic测试结果由表1结果可知,10-HDA对金黄色葡萄球菌的抑制效果明显,最小抑制质量浓度为0.062mg/mL。2.2对细菌生长曲线的影响菌液的光密度值(OD值)可以用来衡量菌液中细菌数目的多少,因此,OD值的变化可以间接的反应10-HDA对金黄色葡萄球菌生长的影响情况。10-HDA对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响见图1。由图1结果可知,无菌水对照组和0×MIC试验组(即DMSO对照组)的菌体生长状态几乎无差别,因此可以忽略10-HDA的溶剂(DMSO)对金黄色葡萄球菌的生长的影响。加入10-HDA的试验组与对照组相比,菌液的光密度值明显降低,表明10-HDA对金黄色葡萄球菌的生长有较好的抑制作用,且随着加入的10-HDA浓度由1×MIC增加到3×MIC,OD2.3对菌体膜渗透率的影响在正常情况下,细菌的细胞膜具有一定的半透性及流动性。当细菌不利生长条件或者抑菌剂作用时,细菌细胞膜会遭到破坏,丧失其半透性并流动性降低,进而菌体的保护屏障被打破,内部的电解质(如K图2反映了金黄色葡萄球菌经10-HDA处理后其菌液电导率的变化情况。由图2可知,无菌水对照组和0×MIC试验组(即为溶剂对照组)的菌液电导率变化不大,因此可以忽略溶剂二甲基亚砜对金黄色葡萄球菌的细胞膜渗透性的影响。而当菌液在1×MIC浓度的10-HDA处理后,菌液的电导率明显高于对照组,这说明了在1×MIC浓度的10-HDA使细胞膜遭到破坏,导致细菌细胞膜流动性降低,通透性增大,从而大量电解质外渗。随着作用时间的延续,菌液的电导率也相应增加,菌体电解质的外泄程度进一步提高,说明菌体细胞内环境和细胞膜稳定性已受到破坏,金黄色葡萄球菌的生长受到抑制。3×MIC的10-HDA对菌体的作用效果更加明显,进一步说明了10-HDA浓度与其对菌体细胞的作用效果正相关。2.4操作膜不透过受膜过氧化细菌的细胞膜是细菌的保护屏障。当菌体细胞通透性屏障受损或其核心受到破坏,使得在正常状态下不能透过细胞膜的具有紫外吸收的大分子物质(如DNA、RNA等)通过细胞膜泄漏到菌悬液中,进而导致菌悬液在260nm处的吸光度值增大2.5对细菌细胞的形态测量原子力显微镜(AFM)是目前研究生物医学样品和生物大分子的必要研究工具。将加入10-HDA的金黄色葡萄球菌菌悬液,以及空白对照组的金黄色葡萄球菌菌悬液在37℃恒温摇床中培养5h后,用AFM观察金黄色葡萄球菌菌体形态。金黄色葡萄球菌的2D效果图,分别如图A-1,图B-1所示,3D效果图分别如图A-2,图B-2所示。从图A-1空白对照组金黄色葡萄球菌的二维形态图中可以看出,空白对照组的金黄色葡萄球菌菌体成近乎圆形,细胞大小均一,对其中一个细胞的大小进行测量,其长度约为1.04μm;从图A-2空白对照组的三维形态图中可以看出,空白对照组的金黄色葡萄球菌细胞饱满,表面光滑。从图B-1和图B-2中可以看出,10-HDA处理金黄色葡萄球菌5h之后,金黄色葡萄球菌细胞表面有褶皱,菌体有凹陷,对其中一个细胞的大小进行测量,长度约为0.87μm,细胞大小明显缩小。试验结果说明,10-HDA能够破坏金黄色葡萄球菌的正常形态,使细胞大小缩小并且表面形成褶皱。其原因可能是由于细胞内容物的大量外泄使得菌体细胞壁凹陷,形成褶皱。2.6活化氢离子检测10-HDA对金黄色葡萄球菌代谢活力的影响结果见图5。活细胞在脱氢酶的作用下生成一种活化氢离子,该离子可以将氯化碘硝基四唑紫还原成稳定的甲瓒,因此可以利用甲瓒生成的速率来推测细胞的代谢活力2.7电泳条带的变化由图6可知,正常金黄色葡萄球菌蛋白的SDS电泳谱带与10-HDA作用下的金黄色葡萄球菌蛋白电泳条带相比,呈现明显差别。10-HDA作用后,蛋白电泳条带明显变浅,有些条带甚至消失,抑制了部分蛋白的正常表达。并且,随着10-HDA浓度的增大,蛋白电泳条带的变化更加明显。为精确10-HDA处理前后金黄色葡萄球菌蛋白含量的变化,我们采用蛋白分析软件Gel-Proanalyzer对金黄色葡萄球菌的蛋白电泳图谱中比较明显的条带进行分析。分析结果如表2所示。从表2的蛋白含量分析结果来看,经10-HDA作用后的金黄色葡萄球菌蛋白含量明显降低,包括r7,r8,r11。此外,10-HDA使得金黄色葡萄球菌中r5条带消失。说明,10-HDA对金黄色葡萄球菌的蛋白表达有一定程度的影响。3对细菌的抑菌机理本文通过倍比稀释法确定10-HDA对金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度为0.062mg/mL,同时,进一步研究了10-HDA对金黄色葡萄球菌的抑菌机