核医学课件：实验核医学

实验核医学

ExperimentalNuclearMedicine核医学临床核医学实验核医学诊断核医学治疗核医学体外诊断体内诊断内照射近距离照射显像核素检查非显像功能测定吸碘率测定肾图放射性示踪放射性标记动力学分析活化分析体外放射分析放射自显影实验核医学利用核技术探索生命现象的本质和物质变化规律，已广泛应用于医学基础理论研究，其内容主要包括放射性示踪、标记、动力学分析、体外放射分析、放射自显影和活化分析等。体外分析(invitroassay)在体外实验条件下，以放射性核素或其他易于探测物质标记的配体(ligand)为示踪剂，以特异性结合反应为基础，探测微量生物活性物质（激素、蛋白质、抗原、药物等）的检测技术。标记物：放射性核素、化学发光物质、荧光物质、酶蛋白等。标记配体：抗原、抗体、受体、配体、激素、氨基酸、微生物等。特点灵敏度高特异性强精密度好应用面广方法简便放射免疫分析

(radioimmunoassay,RIA)Yalow和Berson于1959年创立。应用放射性核素标记抗原作为示踪剂，通过竞争性结合反应，对胰岛素的测定获得成功。1977年Yalow因此获得诺贝尔生理学或医学奖。基本原理在体外条件下，利用定量的放射性核素标记的抗原（标记抗原，*Ag）和非标记抗原（标准Ag、被测Ag）同时与限量的特异性抗体（Ab）进行竞争性免疫结合反应，通过测定放射性免疫复合物的量来计算被测Ag的浓度。*Ag与Ag免疫活性相同*Ag＋Ag>Ab*Ag＋Ag+Ab*Ag-Ab+*Ag

Ag-Ab+Ag(B)Bind(F)FreeAg=*Ag,AgAb=*AgAbAg>*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag<*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag*AgAb*AgAbAgAb*Ag++++++++++++++++++++2550100200400800*AgAb分离B、FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456Ag浓度B%=B/(B+F)F%=F/(B+F)R=B/F2550100200400800*AgAb分离B、FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456B%？Ag浓度B%标准曲线操作基本步骤1.加样：加样总体积要保持一致，所处的介质环境也要一致。2.孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般是37℃。3.分离：选择好的分离方法分离抗原－抗体复合物（B）和游离抗原（F）。4.测量：测量游离或结合物部分的放射性。5.数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。

实际操作中，一般要设立几个反应管：1．最大结合管（Bo）：标准抗原的量为0，只有标记抗原和特异性抗体时，标记抗原与抗体充分反应后分离B和F，所测得的B的放射性为Bo。这是没有标准抗原与之竞争时，标记抗原和抗体的结合达最大值。2．非特异结合管（NSB）：标记抗原除了要和特异性抗体结合以外，还要和一些杂质蛋白或容器的管壁等结合，对我们的分析结果产生影响。NSB管是用蒸馏水代替特异性抗体，在相同条件下反应后测得的放射性。3．总放射性管（T）：反应后不分离就直接测得的放射性就是总放射性。表示标记抗原抗体复合物和游离的标记抗原的总放射性。4．标准管（B1~Bn）：放有不同浓度的标准抗原，再加入相同量的标记抗原和特异抗体。一般在反应后分离出沉淀，测定沉淀的放射性作为B。5．样品管（Bx）：用同剂量的样品代替标准管中的标准抗原，在相同条件下反应和分离，同样取沉淀测得其放射性，就可以在绘制的标准曲线上找到样品的浓度。1.抗体2.标记抗原3.非标记标准抗原（标准品）基本试剂2、标记抗原1）比活度和放化纯度足够高比活度——每微克抗原上标记放射性核素的千贝可数（KBq/μg）放化纯度——具有免疫活性的标记抗原占总放射性的百分数。>95%2）半衰期足够长3）保持原有抗原的特性大分子：125I小分子：3Hor125I3、非标记抗原（标准品）化学结构：与被测物化学结构相同化学纯度：高度纯化化学度量：准确定量稳定性：保持免疫活性不变分离方法双抗体法沉淀法双抗体法+沉淀法吸附分离法固相分离法葡萄球菌A蛋白分离法分离方法的要求分离完全、快速、重复性好。不影响免疫反应的平衡：即是要求在分离过程中不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。受环境因素（温度、PH值等）的影响小。操作简便，分离剂来源丰富、价廉。使用合适的方法以检查、表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许水平。

质控目的：1．通过对一批测定结果的评价，按照要求决定结果的取舍。2．通过对不同批测定结果的评价，发现误差原因，改善实验方法，提高检测质量，保证结果的可靠性。

质量控制

(qualitycontrol,QC)质量控制指标

1、精密度（precision）

即可重复性2、准确度（accuracy）

一般要求达到90%~110%

3、灵敏度（sensitivity）最小可测量4、特异性（specificity）

交叉反应率5、健全性（perfectly）达到实验目标的有效程度6、稳定性（stability）保持原有性能不变的能力ABC体外放射分析的质控实验室内部质控实验室外部质控批内质控批间质控批内精密度与偏听偏信倚分析批间精密度与偏听偏信倚分析寻找误差产生的原因、改进分析工作质量对某种分析方法、试剂或试剂盒进行综合评价对不同实验室的分析工作质量进行比较向主管部门提供信息，对方法、试剂（盒）进行改进，促进实验室内部的质量控制工作实验室内部质控

（internalqualitycontrol，IQC）是一个实验室内部实验方法的质量控制，以便在一个人的同一批或不同批实验中，不同操作者和不同方法之间有可比性。包括批内质控和批间质控。最高结合率(B0%)一般要求在30%～50%非特异性结合率(NSB%)一般要求＜5%最低浓度管结合率和最高浓度管结合率之差要求大于30%标准曲线直线回归的参数要求a、b值稳定，r＞0.99ED25、ED50与

ED75指标准曲线的结合率在25%、50%和75%时对应的抗原浓度值，反映标准曲线的稳定性，有助于批间结果的比较。质控图连续测定10批以上高、中、低三种已知浓度的质控血清，求出各自的均数及标准差x±s，然后作图。以后每次分析时均要同时测定此高、中、低质控血清，将测定值标在图上。

WHO要求，在一次实验中有下列情况之一者，其结果应予舍弃：①三种QCS中有一个测定值＞3s②三种QCS中在同一方向上有两种＞2s③三种QCS均在同一方向上＞1s质控图实验室外部质控

（externalqualitycontrol，EQC）目的：提高各实验室之间检测结果的可比性。方法：在权威机构的领导下，使用相同质控血清，按照统一的评价方案和方法，对各实验室之间的测定结果进行比较分析，发现误差，找出原因，提出改进方法，以提高实验室之间所得结果的可信性和可比性。免疫放射分析

(immunoradiometricassay，IRMA)将过量的标记抗体与抗原结合，分离结合的标记抗体与未结合的多余的标记抗体，测定复合物的放射性，其活度与待测抗原的量呈正相关。Ag＋*Ab

Ag-*Ab＋*AbAg为抗原，*Ab为标记抗体，Ag-*Ab为抗原与标记抗体的复合物。IRMA的实验方法双抗体夹心法标记第三抗体法双标记抗体法生物素-亲和测定系统IRMA的特点标记物的放射性活度高反应达到平衡快比RIA更高的灵敏度（约10～100倍）比RIA的标准曲线范围更宽比RIA的特异性更高稳定性好目前仅能检测大抗原B%B%拟合的标准曲线拟合的NSB拟合的标准曲线拟合的NSBIRMA的标准曲线及非特异结合曲线RIA的标准曲线及非特异结合曲线IRMA和RIA低剂量区的不确定因素示意图RIA++或01IRMA+1IRMA与RIA工作原理的主要区别RIAIRMA竞争性抗原抗体结合反应非竞争性抗原抗体结合反应采用标记抗原采用标记抗体三种主要反应试剂二种主要反应试剂所用抗体是限量的所用抗体是过量的*AgAb的量与待测Ag的量呈负相关Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关反应到达平衡慢反应到达平衡快非特异结合主要影响高剂量区非特异结合主要影响低剂量区低剂量区有不确定因素低剂量区无不确定因素其它体外放射分析法放射受体分析法竞争性蛋白结合分析法放射酶学分析法放射微生物分析法放射受体分析法(radioreceptorassay,RRA)基于受体与配体的特异性结合的分析方法，其竞争结合原理与放射免疫分析相似。如肽类激素受体、儿茶酚胺受体等。竞争性蛋白结合分析法(competitiveproteinbindingassay，CPBA)不需要抗体，用血浆或其他生物组织中存在的特异结合蛋白质作为结合剂对某些物质进行微量分析。如甲状腺激素结合蛋白、皮质类固醇结合蛋白等。放射酶学分析法(radioenzymaticassay,REA)以特异酶作为结合剂。如蛋白激酶测定环核苷酸。放射微生物分析法(radiomicrobiologicassay)以特异微生物作为结合剂。如用某种微生物测定叶酸。非放射性标记免疫分析技术化学发光免疫分析技术酶免疫分析技术荧光免疫分析技术化学发光免疫分析技术

(chemicalluminescentimmunoassay，CLIA)利用化学发光物质代替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能形成激发态产物，并在退激时将能量转化为光子的物质。直接化学发光免疫分析化学发光酶免疫分析电化学发光免疫分析生物发光免疫分析用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。应用最多的就是酶联免疫吸附分析法。结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性的检测技术，灵敏度高，特异性强，易操作。酶标记免疫分析技术

(enzymeimmunoassay，EIA)

ELISA是用酶分子标记抗体，进行与IRMA相似的夹心法免疫反应。反应结束后分离结合部分和游离部分，利用结合部分上的酶分子的催化活性将底物转化为特定的颜色，用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而酶量又和复合物的量成正比。常用的酶是辣根过氧化物酶，底物是四甲基联苯胺(TMB)，反应后显黄色。酶联免疫吸附分析法

(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)

荧光免疫分析技术

(fluorescenseimmunoassay，FIA)利用荧光检测技术与抗原抗体反应相结合的一种非放射性免疫分析方法。主要分为以下三种类型：时间分辨荧光免疫分析荧光偏振免疫分析荧光酶免疫分析

微生物——RMA

酶——REA

受体——RRA

特异结合蛋白——CPBA

改变结合体对放射性技术Ag

Ag-Ab

RIA+Ab免疫学技术※Ag

※Ag-Ab

改变标记物第一阶段第二阶段第三阶段小分子半抗原联接125I单克隆技术固相技术药品化Kit理论与实践上更丰富更完善的RIA1.可测物达300多种2.涉及多个临床与基础学科3.

RIA显像4.

RIA治疗

荧光—FIA—IRMA化学发光—CIA

酶—EIA放射自显影

(Autoradiography,ARG)利用射线使感光材料感光形成潜影，经显影定影后形成图像，判断放射性示踪剂的分布部位和数量（半定量）的技术。宏观自显影

(macroscopicARG)又称大体自显影，观察范围较大，分辨率低，只能供肉眼或放大镜观察，或根据黑度判断示踪剂的分布和相对数量。适用于小动物的整体标本，大动物的脏器或肢体，以及层析板、免疫沉淀板、骨骼、牙齿的磨片或剖面等。光学显微镜自显影

(lightmicroscopicARG)借助显微镜进行组织或细胞学观察，分辨率较高，根据银颗粒判断示踪剂的分布部位和数量。适用于组织切片、细胞涂片等标本。电子显微镜自显影

(electronmicroscopicARG)用于示踪剂在亚细胞结构中分布情况的研究，能显示普通显微镜观察不到的细微结构与放射性核素分布的关系。适用于细胞超微结构，甚至大分子（DNA、RNA）上的精确定位和定量，也可观察动态过程。要求标本在100nm以下的超薄切片，乳胶厚度仅相当于银颗粒直径（约140nm）。感光材料类型组成溴化银直径（µm）厚度（µm）用途原子核乳胶溴化银明胶0.1-0.24光镜自显影电镜自显影氚片溴化银碘化银明胶1.05-103H标记化合物的宏观自显影X线片溴化银碘化银明胶2.5-3.015-30核素能量较高的宏观自显影放射性核素的选择能量低、射程短、半衰期长的核素。纯β射线核素(3H、14C、32P、35S、45Ca、59Fe)β、γ衰变核素(131I)电子俘获衰变的核素(125I、51Cr)γ跃迁的核素(99Tcm)电子俘获、γ跃迁核素的核素发射的俄歇电子和内转换电子也可形成较好的自显影图像。纯γ射线穿透力强，自显影效果差。常用放射性核素放射性示踪技术以放射性核素或其标记的化合物作为示踪剂，应用射线探测仪器，通过探测标记在化学分子上的放射性核素发射的射线，来显示被标记化学分子的踪迹，用于研究示踪剂在生物体系或外界环境中的分布及其变化规律的一门科学。是核医学基础研究和临床应用的方法学基础。放射性示踪技术的特点灵敏度高（-1810~

-1410g）方法简便、准确合乎生理条件定性、定量、定位与动态研究相结合专业技术性强放射性示踪技术类型体内（invivo）示踪技术脏器与组织显像放射性核素治疗功能测定体液与细胞容积测定物质代谢、转化及动态平衡体外（invitro）示踪技术体外放射分析细胞动力学放射自显影活化分析放射性核素稀释法是将待测元素与放射性同位素示踪剂充分混合，然后分离出一部分纯净待测样品，测其比活度，由比活度的变化来计算出待测元素的含量。化学上这种方法常用来测定不易分离组分的含量，可分为正稀释法和反稀释法。医学上可用于测定血容量、全身水含量及细胞外液量等。正稀释法也称直接稀释法，是将一种比活度和质量已知的放射性核素或其标记化合物作为标准物加到含有该放射性核素的稳定同位素或其化合物中，混合均匀后分离提出其中的一部分，然后测其比活度，计算待测物的含量。反稀释法是将一种质量已知的稳定同位素加到含有其放射性同位素的待测样品中，混合均匀后分离提纯一部分化合物，再测定其比活度，计算出待测样品中原有放射性同位素的质量。掺入试验3H-TdR掺入DNA作为淋巴细胞转化的指标观察细胞免疫情况；3H-TdR掺入试验研究细胞周期；125I-UdR掺入RNA试验研究肿瘤细胞增殖速度、研究各种抗肿瘤药物作用；通过标记不同前身物（如氨基酸、核苷酸等）研究蛋白质、核酸等生物大分子的合成、结构、