酶工程实验报告五(纤维素酶米氏常数-Km的测定)

PAGEPAGE2实验名称实验方式小组成员实验五：纤维素酶米氏常数——Km的测定小组合作XXXXXXXX实验目的1.1了解底物浓度对酶促反应的影响。1.2掌握测定米氏常数Km的原理和方法实验仪器、试剂和溶液：2.1仪器：紫外分光光度计、比色皿（3个）、恒温水浴锅、试管架（1个）、l移液管、洗耳球、标签（若干）等。2.2试剂和溶液2.2.1柠檬酸钠缓冲液，0.05mol/L，pH4.82.2.210mg/ml的CMC-Na溶液（底物溶液）2.2.3DNS试剂（CMCA-DNS）2.2.4稀释到200倍的纤维素酶液3、实验原理或装置示意图：3.1原理:Km定义：Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度。3.2Km的意义Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同。Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲和力大。测定Km值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的Km值在0.01-0.00001mmol/L。（0.01～100mol/L）3.3米氏方程：V[S]v=Km+[S]v：反应初速度（微摩尔浓度变化/min)V：最大反应速度（微摩尔浓度变化/min)[S]：底物浓度（mol/L)Km：米氏常数（mol/L)此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。3.4双倒数作图法测定Km值：1Km11vV[S]V1/v对1/[S]作图可得一条曲线，其斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax。若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于-1/Vmax。本实验采用最适pH、最适温度下，测定不同浓度时酶活性。再根据林贝法作图求出Km值。3.5纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 4、实验方法步骤、操作流程及注意事项：4.1实验方法与步骤：1、将预先准备好的200倍纤维素酶液酶准确稀释到10000倍待用。2、每个底物浓度取三支250ml试管，一直空白，两只对照，待用。3、预热：参照下表：表一纤维素酶Km值的测定各管中底物液、缓冲液和酶液的用量mlCMC-Na溶液（10mg/ml）pH4.8柠檬酸钠缓冲液酶液最终CMC-Na浓度（g/ml）0.21.80.510.41.60.520.61.40.530.81.20.541.01.00.551.20.80.561.40.60.571.60.40.581.80.20.592.00.00.510注：DNS与定容用的蒸馏水分别为：3ml，19.5ml。（1）按上述配制方法分别将不同浓度底物2ml底物（mg/ml）和稀释到10000倍纤维素酶液于50℃水浴中保温10min。（2）准确计时后，将保温后的酶液各取0.5ml迅速加入保温后的不同浓度底物溶液中，振荡混匀，并立即用秒表计时，在50℃水浴中继续保温30min。3、测定步骤（1）反应混合物物保温30min后，于各个浓度底物试管中加入3mLDNS试剂终止液，迅速振荡均匀。（2）于不同底物浓度的空白对照试管中加入0.5ml的酶液。（2）将各底物浓度的三支试管沸水浴5min，自来水冷却后，加蒸馏水19.5mL。摇匀，在540nm处读取OD值。4、作图分析：以1/v对1/[S]作一条曲线，求截距为1/Vmax。注：本实验在纤维素酶最适反应条件50℃、pH4.8下测定不同底物浓度的纤维素酶km值。4.2操作流程：A稀释:原酶液底物↘↙B预热:各预热10min↙↘C取液:稀释到10000倍的纤维素酶液0.5mL2mL不同浓度的底物溶液↓D反应50℃水浴中保温30min↓F测定=1\*GB3①3mLDNS反应终止→=2\*GB3②沸水浴5min→=3\*GB3③定容至25ml→=4\*GB3④测定OD540吸光值G作双倒数图求Km4.3实验注意事项本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。严格控制准确的酶促反应时间。=1\*GB3①反应温度准确，酶液准确稀释。不同pH所用酶液用对应pH缓冲液稀释=2\*GB3②试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；=3\*GB3③移液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。=4\*GB3④精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；=5\*GB3⑤避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；5、实验结果与数据处理：5.1实验数据与结果：如表二表二实验测定结果1/[S]与1/V底物浓度mg/ml1/[S]OD540吸光值1/V1.01.0000.04025.002.00.5000.04223.813.00.3330.04422.724.00.2500.1875.3485.00.2000.2254.4446.00.1670.2304.4387.00.1430.4272.3428.00.1250.4442.2529.00.1110.5111.96010.00.1000.5191.9275.2结果处理1/v对1/[S]作曲线图：如下图一以1/[S]为横坐标,1/v为纵坐标作图得一直线,将此直线延长交横轴负侧。当1/[S]为0时,l/Vmax就是直线在纵轴上的截距（Vmax即为它的倒数值）；当1/v为0时,直线向左延伸与横轴负侧的交点即为一1/Km,求出其倒数的正值,即为Km值。由图-1/Km=-7,可得出：Km=0.143mg/ml(g/L)/(2×104)=0.715×10-5mol/L。6、分析与讨论：米氏常数（Km）是酶的一个特征性物理量，其大小与酶的性质有关。Km值随测定的底物种类、反应的温度、pH及离子强度而改变。因此，对某一酶促反应而言，在一定条件下都有特定的Km值，可用来鉴别酶，例如对于不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状况下催化相同反应的酶是否属于同一种酶[1]。有的酶可作用于几种底物，因此就有几个Km值，其中Km值最小的底物就是该酶的最适底物也就是天然底物，最适底物对酶的亲和力最大。Km值随不同底物而异的现象可以帮助判断酶的专一性，并且有助于研究酶的活性中心部位。本次实验中测定结果误差较大，结果不可靠。因此作图中只选取了其中三个连续变化的点，若用10个测定结果作图后线性关系非：y=kx+b的直线方程型[3]。徐桦（1999）,等对酵母蔗糖酶Km值的测定采用6个稀释浓度的底物结果如图二：作图求Km和本次实验相同,相比较一次函数线性关系比较好，结果更准确。图二酵母蔗糖酶的Km值图二7、实验小结：=1\*GB3①掌握纤维素酶Km测定方法，意义。=2\*GB3②稀释底物做到准确，量取固体酶液时精确，溶解稀释做到准确无误，减少实验操作误差，增加结果可信度。=3\*GB3③测酶活时严格控制影响到的因素，如反应温度、时间、pH等。改进：为使结果准确，可信尽可能减少操作人为的、系统的不必要误差做到：每个小组做实验中尽可能完成1～10各个浓度准确，这样可以减少由于每组测定结果的差异，使最后做双倒数图时线性程度高。Km更可靠。8、实验思考题：Km值意义?答：Km是酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同，Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大