激光扫描共聚焦显微镜-图文讲解

..激光扫描共聚焦显微镜吴旭2008.10.14高级显微镜原理正置、倒置显微镜细胞遗传工作站活细胞工作站激光显微别离系统激光共聚焦显微镜概述激光扫描共聚焦显微镜〔Laserscanningconfocalmicroscope，LSCM〕生物医学领域的主要应用通过一种或者多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进展亚细胞水平构造功能研究高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞构造和功能的分析检测……ConventionalfluorescencemicroscopeConfocalmicroscope历史1957年，MarvinMinsky提出了共聚焦显微镜技术的某些根本原理，获得了美国的专利。1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。1984年，Biorad为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。1986年MRC-500型改良为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。ConfocalmicroscopyesofageJGWhite&WBAmos.Nature328,183-184(09July1987Zeiss、Leica、Meridian、OlympusZeissLSM510激光扫描共聚焦显微镜ZeissLSM510META激光扫描共聚焦显微镜ZeissLSM510META激光扫描共聚焦显微镜NikonA1R激光扫描共聚焦显微镜PrairieUltimaIV活体双光子显微镜国家光电实验室〔〕自制随机定位双光子显微镜LeicaTCSSP5激光共聚焦扫描显微镜根本原理相差、DIC常用荧光标记共聚焦原理Twowaystoobtaincontrastinlightmicroscopy.Thestainedportionsofthecellin(Areducetheamplitudeoflightwavesofparticularwavelengthspassingthroughthem.Acoloredimageofthecellistherebyobtainedthatisvisibleintheordinaryway.Lightpassingthroughtheunstained,livingcell(Bundergoesverylittlechangeinamplitude,andthestructuraldetailscannotbeseeneveniftheimageishighlymagnified.Thephaseofthelight,however,isalteredbyitspassagethroughthecell,andsmallphasedifferencescanbemadevisiblebyexploitinginterferenceeffectsusingaphase-contrastoradifferential-interference-contrastmicroscope.D.Phase-contrastoradifferential-interference-contrastmicroscopeFourtypesoflightmicroscopy.(ATheimageofafibroblastincultureobtainedbythesimpletransmissionoflightthroughthecell,atechniqueknownasbright-fieldmicroscopy.Theotherimageswereobtainedbytechniquesdiscussedinthetext:(Bphase-contrastmicroscopy,(CNomarskidifferential-interference-contrastmicroscopy,and(Ddark-fieldmicroscopy.常用荧光探针ProteinsNucleicAcidsDNAIonspHSensitiveIndicatorsOxidationStatesSpecificOrganelles荧光显微镜原理明场：透射荧光：落射落射的优点：物镜的聚光镜作用使视场均匀，发射光强度高。激发光损失小，荧光效应高。共聚焦原理由于pinhole的存在，使得局部杂散光〔虚线局部〕没有被PMT探测器探测到，从而提高了成像效果。通过对样品在x-y方向上的逐点扫描，可以形成二维图像。如果调解焦平面在z方向的位置，连续扫描多个不同z位置的二维图像，那么可以形成一个3D图像，3D的重建需要软件的支持。TheuniquescanningmoduleisthecoreoftheLSM510META.Itcontainsmotorizedcollimators,scanningmirrors,individuallyadjustableandpositionablepinholes,andhighlysensitivedetectorsincludingtheMETAdetector.Alltheseponentsarearrangedtoensureoptimumspecimenilluminationandefficientcollectionofreflectedoremittedlight.AhighlyefficientopticalgratingprovidesaninnovativewayofseparatingthefluorescenceemissionsintheMETAdetector.Thegratingprojectstheentirefluorescencespectrumontothe32channelsoftheMETAdetector.Thus,thespectralsignatureisacquiredforeachpixelofthescannedimageandsubsequentlycanbeusedforthedigitalseparationintoponentdyes.分光镜组件构造共聚焦构成•光学显微镜•激光光源•扫描模块〔包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜〕•光检测器•计算机系统〔数据采集、处理、转换应用〕•图形输出设备LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管图像相关概念RGB三基色图像数据位亮度比照度饱和分辩率怎样得到样品图像样品的标记物有适宜的激发波长和发射波长荧光下观察选择适宜的图象设置激光扫描的通道参数设置图象的属性调节每一个通道的亮度、比照度、清晰度、背景亮度启动共聚焦和CCD照片的比拟更大的动态围高灵敏度图像背景的消除灵活的拍照区域选择ZOOM功能伪彩色环境要求高多通道图象合成时间序列Ca离子成像FRAP：FluorescenceRedistributionAfterPhotobleachingFRAP是用来测定活细胞的动力学参数，借助于高强度脉冲激光来照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子的光粹灭，该区域周围的非粹