细胞培养方法及应用实例

第二节细胞培养方法及应用实例一、动物细胞培养方法二、植物细胞培养方法三、细胞培养反应器四、细胞工程应用实例Celldevelopmentmethodandit’sappliedsolidexample一、动物细胞培养方法

根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培养及固定化培养等三种方法。1.贴壁培养

所谓贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面（如：培养皿、培养瓶等）进行的培养。⑴生长特性

贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。⑵主要优点

细胞紧密黏附于固相表面，易更换培养液；易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统；适用于所有类型细胞。

⑶主要缺点

与悬浮培养法相比：扩大培养比较困难，投资大；占地面积大；不能有效监测细胞的生长。⑷细胞贴壁的表面

要求具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具一定电荷密度；若为有机物表面，必须具有亲水性，并带阳电荷。2.悬浮培养

悬浮培养是对非依赖性细胞培养的一种方法。某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择也可用此方法培养。悬浮培养投资较小，扩大培养规模简单（只须增大培养体积）。如：淋巴细胞的培养可采用悬浮培养法。细胞悬浮培养瓶进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。

在悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将3.固定化培养

所谓固定化培养是指，将动物细胞与不溶性载体结合起来进行培养的方法。简单地，说就是将被培养生物体固定在一定的培养基上进行培养的过程。动物细胞的固定化易于细胞与产物的分离及产品的纯化。因此，固定化是实现动物细胞高密度长期培养、从而提高生物反应器生产效率的重要技术途径。常见的固定化方法有：吸附法、共价贴附法、交联法和包埋法等。⑴吸附法

所谓吸附法是指：用固体吸附剂将动物细胞吸附在其表面，从而使细胞固定化。吸附法的主要优点是：操作简便、条件温和；其主要缺点是：载体的负荷能力低，细胞易脱落。⑵共价贴附法

所谓共价贴附法是指：利用共价键将动物细胞与固体载体结合的细胞固定化方法。共价贴附法连接键非常牢固，能有效地减少细胞泄漏；因化学试剂的引入，对细胞的活性有一定的影响。⑶交联法

使用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团如氨基、羧基等进行交联，形成共价键来固定细胞，其结合力是共价键。此法制备的细胞与载体结合紧密，但制备麻烦，活力损失较大。

包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微胶囊型两种。⑷包埋法二、植物细胞培养方法

常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养等方法。1.愈伤组织培养

所谓愈伤组织培养是指，将外植体接种到人工培养基上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。植物组织(消毒)MS培养基愈伤组织切取接种培养什么是愈伤组织？长出茎、叶生根培养试管苗资料卡片愈伤组织（callus）

在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。愈伤组织在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。

在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期。即：启动期（细胞准备进行分裂期）、分裂期和形成期。2.原生质体培养

取植株的幼胚、根、茎或叶等组织细胞，用纤维素酶或果胶酶除去植物体细胞的细胞壁（原生质体），在培养基上生长分裂，通过愈伤组织诱导分化长出茎、叶，再长出根形成植株。植物细胞愈伤组织长出茎、叶生根培养驯化移栽原生质体分离破壁接种、培养分化培养生根试管苗3.花粉培养

在无菌条件下取出花药或花粉粒（小孢子），置于培养基上进行人工培养，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株。接种花药花粉愈伤组织单倍植株花粉植株三、细胞培养反应器

细胞培养反应器种类繁多，根据细胞的培养方式不同，可将其分为悬浮培养反应器、贴壁培养反应器及固定化培养反应设备等。1.悬浮培养反应器——搅拌式反应器

常见的悬浮培养反应器如：搅拌式反应器、液体循环式反应器和鼓泡式反应器等类型，其工作原理与相应的微生物反应器（发酵罐）相同。

对于动物细胞，因没有细胞壁的保护，对搅拌剪切作用十分敏感，直接的机械搅拌很容易对其造成损害。同样，植物细胞的纤维素细胞壁虽然使细胞具有很强的抗张强度，却使其抗剪切的能力相当弱。因此，传统用于微生物的搅拌反应器用作细胞的培养，须对搅拌方式加以改进。5L细胞培养罐

一般情况下搅拌式反应器还常伴有鼓泡，为动物细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感，所以须供氧方式上进行改进。笼式供氧是搅拌式动物细胞反应器供氧方式的一种，即气泡用丝网隔开，不与细胞直接接触。这样，反应器既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力，以满足细胞生长的要求。⑴供氧方式的改进

搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大，这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。例如：采用双螺旋带状搅拌桨，并在顶部法兰盖安装3块表面挡板。挡板以相对于径向的夹角为30°垂直插入液面。由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的旋涡。⑵搅拌浆的改进

中空纤维反应器因其剪力小被广泛运用于动物细胞的培养。中空纤维反应器主要由中空纤维管组成，中空纤维管的内径为200μm，壁厚为50～70μm。管壁是多孔膜，O2和CO2等小分子可以自由透过膜扩散，动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长，可以很方便地获取氧气。封闭式中空纤维反应器循环系统2.贴壁培养反应器——中空纤维反应器

常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器等类型。3.固定化细胞培养设备

细胞到生长后期，其生长速度降低，有利于细胞分化及次级代谢产物积累，则需对其进行固定化培养。固定化培养有利于细胞组织化，易获得高密度细胞群体，易于控制培养条件及获得代谢产物。⑴平床细胞培养系统

平床培养又称为平板培养，该系统是由培养床、储液罐和蠕动泵等部件构成。平床培养系统示意图蠕动泵培养床进液管储液罐

将新鲜细胞固定在由聚丙烯材料编织成的无菌平垫（床）上，通过储液罐下方管道滴注培养液。培养床上的培养液再经过蠕动泵循环送回储液罐中。平床细胞培养系统设备较简单，比悬浮细胞培养能更有效地合成次级代谢产物。⑵立柱细胞培养系统

立柱培养系统同样是由培养床、储液罐和蠕动泵等部件构成。立柱培养系统示意图蠕动泵培养床进液管储液罐

立柱式细胞培养系统主要用于植物细胞培养。该培养系统是将植物细胞与琼脂或褐藻酸钠混合，制成2－3cm3的细胞团块，并将其集中于无菌立柱中。这样，由储液罐滴注的培养液流经大部分细胞——“滴液区”比例与平床培养系统相比，将大大提高。问题思考与讨论8－5常见的动物、植物组织细胞培养方法有哪几种？8－6什么是细胞的固定化培养？8－7什么是愈伤组织？四、动物细胞工程应用实例20世纪60年代为了满足生产疫苗的需要，开始运用动物细胞大规模培养技术。后来随着动物细胞大规模培养技术的逐渐成熟和转基因技术的发展与应用，人们发现利用动物细胞大规模培养技术生产大分子药用蛋白质比原核细胞表达系统更有优越性。1.甲型H1N1流感疫苗的生产

甲型H1N1流感病毒与其它季节性流感病毒不同，该病毒毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段。人群对甲型H1N1流感病毒普遍易感，并可以人传染人。⑴甲型H1N1流感病毒⑵甲型H1N1流感疫苗的生产流程原始种子（基因重组病毒株）病毒接种增殖培养生产用病毒种子生产前准备病毒接种病毒培养病毒液病毒灭活液病毒灭活病毒纯化液浓缩纯化配比分包疫苗产品病毒培养①原始种子——基因重组病毒株

世卫组织提供的6支甲型H1N1流感原始毒株

当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于亲代的可遗传的子代，称为基因重组。基因重组病毒有“活病毒基因重组”、“灭活病毒基因重组”及“死活病毒基因重组”。重组病毒株原始种子属于死活病毒间的重组。

基因重组病毒株原始种子保留了病毒的抗原性和复制能力，降低了病毒的致病力（由世卫组织提供）。因为世卫组织提供的基因重组病毒株量较少，不足以进行批量生产疫苗，必须对其进行扩增培养，制备病毒种子批。

例如：将能在鸡胚中生长良好的甲型流感病毒（A0或A1亚型）疫苗株经紫外线灭活后，再加亚洲甲型（A2亚型）活流感病毒一同培养，产生出具有前者特点的A2亚型流感病毒，可供制作疫苗。②生产前准备无菌生产鸡胚原始种子（基因重组病毒株）病毒稀释增殖培养生产用病毒种子选胚接种培养基【选胚】

培养生产用病毒种子需要无菌生产的9—11日龄鸡胚。要求鸡胚的外壳为白色、整洁，透光性好，在暗室光源的照射下，可以清晰地看到鸡胚里的血管等，这样可以很容易剔除弱胚、死胚等。【接种、培养】

将稀释后的病毒种入选择的鸡胚尿囊腔中，随后将鸡胚放入密闭、无菌、恒温的孵化箱中繁殖病毒。最后从鸡胚尿囊腔里中液体中得到疫苗生产用的种子。③病毒培养原始种子病毒培养生产用病毒种子生产前准备病毒接种（鸡胚）病毒液

将得到的生产用病毒种子接种到无菌鸡胚中进行培养，得到病毒液。清洗消毒接种病毒灭活灭活试验及其它检验灭活剂(HC－H)病毒灭活液

世卫组织提供给疫苗生产厂家的毒种尽管感染性很低，但由于仍然是活的病毒，所以还需要对生产出来的病毒进行灭活处理以去除病毒的致病力。通过往病毒收获液中加入灭活剂（如：甲醛），破坏病毒外壳的酯类成分，使其丧失感染正常细胞的能力。④病毒灭活病毒液病毒收获机

在进入下一工序前，须对病毒灭活液进行灭活试验，确保疫苗已经灭活——得到病毒灭活液。O2－8℃7～10D

病毒灭活液中有很多的杂质，必须加以纯化，以保留病毒作为疫苗的有效成分—抗原，去除病毒灭活液中的其它杂质，避免这些杂质对人体产生不良反应。病毒灭活液的浓缩纯化有多条路线可走。例如：⑤浓缩纯化病毒灭活液浓缩液超滤浓缩层析蔗糖液or密度梯度离心法层析液病毒灭活液超滤蔗糖洗脱裂解超滤液裂解剂除菌过滤病毒纯化液配比分包疫苗产品病毒纯化液检定

抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群——单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。单克隆抗体是由一种类型的细胞制造出来的抗体。浆细胞2.HBsAg单克隆抗体的生产⑴单克隆抗体①单克隆抗体

要制备单克隆抗体，首先需获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。②单克隆抗体技术的基本原理B细胞HGPRT+HGPRT骨髓瘤细胞融合(HAT)培养基HGPRT+HGPRT存活的杂交瘤长期体外培养死亡有氨基蝶呤死亡

实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，又有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。HGPRT：次黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶HAT：次黄嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶待融合用骨髓瘤细胞（准备）脾淋巴细胞制备⑵HBsAg单克隆抗体的生产流程

抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)单克隆抗体是专一识别HBsAg的单一抗体，能与HBsAg产生免疫反应。运用免疫大鼠脾淋巴细胞与大鼠骨髓瘤的IR983F细胞融合技术制造抗HBsAg单克隆抗体的生产流程如下：健康大鼠(处死)饲养细胞制备脾脏大鼠骨髓瘤(IR983F细胞)细胞融合饲养备用细胞培养浓缩纯化冻干抗HBsAg单克隆抗体（精品）生产前准备【抽取细胞液】

先将大鼠处死，并向其腹腔内注射10mLDMEM培养液，轻压腹腔使细胞悬浮，吸出全部细胞悬浮液。【细胞分离】

离心分离5min，用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4）洗涤，收集细胞。【细胞培养】

用10％小牛血清、100U/mL青霉素和链霉素、HAT的DMEM培养液制成悬浮，置于37℃CO2培养箱中进行温育。①饲养细胞制备

在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞。因此，制备免疫大鼠脾淋巴细胞时应先制备其饲养细胞。饲养细胞的制备工序如下：抽取细胞液健康大鼠(处死)细胞培养饲养细胞(备用)细胞分离②免疫大鼠脾淋巴细胞的制备健康大鼠(处死)洗涤脾脏抽取细胞液离心分离免疫大鼠脾淋巴细胞（备用）细胞悬浮液沉淀物DMEM培养液红细胞磷酸缓冲液【洗涤】

在冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。【抽取细胞液】

用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。【离心分离】

直立小试管3min，使结缔组织下沉；然后将细胞悬液移入离心管中进行离心分离。③待融合用大鼠骨髓瘤细胞的准备接种(DMEM培养液）培养(37℃，15-20h）大鼠骨髓瘤细胞(IR983F细胞)制成悬浮液离心沉淀制成悬浮液DMEM培养液待融合用大鼠骨髓瘤细胞(备用)

亲本IR983F细胞一般由有关单位提供

通过融合前的准备工作，得到了免疫大鼠脾淋巴细胞和待融合用大鼠骨髓瘤（亲本）细胞后，可对其进行细胞融合。免疫大鼠淋巴细胞大鼠骨髓瘤细胞细胞融合融合混合物层析层析液超滤、浓缩浓缩液冻干抗HBsAg单克隆抗体（精品）⑤浓缩纯化杂交细胞混合物④细胞培养孔板培养细胞培养融合混合物细胞筛选抗HBsAg单克隆抗体培养液3.迷迭香抗氧化剂的生产⑴迷迭香及其重要成分

迷迭香(Rosmarinusofficinalis)、被子植物门、双子叶植物纲、唇形目、唇形科、迷迭香属灌木植物。迷迭香中含有迷迭香精油及抗氧化剂，其抗氧化成分主要为鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酚、熊果酸、迷迭香酸等。Rosmarinusofficinalis①迷迭香②迷迭香精油（ROSEMARY）

迷迭香精油中主要含有α－蒎烯、1，8桉叶素、莰烯、樟脑、龙脑和β－蒎烯等成分。【主要功效】

迷迭香精油具有较强的皮肤收敛作用，调理油腻不洁的肌肤，促进血液循环，刺激毛发再生；具有强心剂、降血压、调理贫血作用；具有提神、醒脑、恢复中枢神经活力；具有改善感冒、气喘、慢性支气管炎与流感作用；具有增强消化功能，改善结肠炎、消化不良、胀气和胃疼等功效。③迷迭香酸（Rosmarinicacid）

迷迭香酸具有很强的抗氧化性，其抗氧化活力强于维生素E。迷迭香酸有助于防止自由基造成的细胞受损，降低癌症和动脉硬化的风险。也被用于食品防腐。【主要功效】

抗氧化、延缓衰老；强减肥降脂功效；治疗心血管病及抗癌④鼠尾草酸（Carnosicacid）

鼠尾草酸具有较强的油溶性成分抗氧化性。在调味酱、宠物食品和饲料中使用，有助于防止自由基造成的细胞受损，降低癌症和动脉硬化的风险的主要。【主要功效】

抗氧化、延缓衰老；强减肥降脂功效；治疗心血管病及抗癌迷迭香抗氧化剂提取物⑵迷迭香抗氧化剂的生产流程迷迭香顶芽扦插繁殖移栽油水分离水蒸气蒸馏枝叶馏分减压蒸馏油层迷迭香精油渣晾干粉碎抗氧化剂提取原料过滤液迷迭香抗氧化剂原料浸