dna的粗提取与鉴定实验的改进

dna的粗提取与鉴定实验的改进

“从本质上提取和鉴定”是高中生物材料的实验。在新教材《生物技术》（成人教育版）中对“dna和蛋白质技术”进行了分析。一章5。学习的学生主要是理科生中对生命科学有浓厚兴趣的学生,如何在普通高中实验室条件下、做好这个实验?笔者在许多高中教师实验“简化”的基础上,进行了研究和优化。该实验的材料可以选择动物材料(如鸡血),也可以选择植物材料(如菜花、洋葱、香蕉等)。前者,取材不方便、成本高、实验操作步骤多、耗时长,效果不明显;后者,菜花含水量少、细胞破裂情况及DNA溶出量少查阅了近几年文献资料,以香蕉为实验材料进行DNA的粗提取与鉴定,高中教师受条件限制(如无EDTA、Tris、氯仿、异戊醇和离心设备等),仍摸索总结出一些“简化”实验的方法,其中有详细实验步骤描述的是郑焕强老师1“简化实验”的原型1香蕉研磨法(1)加5mL温水和食盐研磨一段约2cm长的去皮香蕉。(2)研磨均匀后再加温水,总加水量约为实验所用香蕉体积的3~4倍。(3)用纱布过滤研磨液,存入广口瓶。留研磨液量约1/6~1/8瓶。2冰酒精研磨液量的确定(1)向广口瓶内加入1~2汤匙洗洁精,按一定方向轻摇5min。(2)沿玻璃棒从瓶壁缓慢加入75%~90%的冰酒精,加入量约为研磨液量的3~4倍。(3)静置5min后,用玻璃棒缓缓卷起上层漂浮的DNA粗提取物,放入已注有5mL物质的量浓度为0.015mol/L的氯化钠溶液的大试管中,搅拌使其充分溶解备用。3“dna”粘连物11个实验小组进行到实验步骤2时,都能迅速见到乳白色滤液分为上、下层,下层较浑浊,上层澄清、漂浮着析出的白色絮状的“DNA”粘稠物(图1),用玻璃棒(牙签代替)卷起很多粘稠物(图2);但是,DNA鉴定时只有1组有明显的颜色反应(变蓝色),其他各组只是难以识别的、淡淡的浅蓝色或者不变色。2含dna量少,纯度较低析出的白色絮状粘稠物,能够溶于2mol/L的NaCl溶液,说明含有DNA;但是,DNA鉴定时,多数是淡淡的浅蓝色或者不变色,说明含DNA量较少、纯度较低。师生共同分析,可能絮状提取物中含有大量蛋白质,一致认为用双缩脲试剂检验,结果溶液变紫色。如何提取到更多的DNA,并去除滤液中的杂质、获取较为纯净的DNA呢?学生根据教材第54~57页的理论,提出2个主要问题。2.1在“研磨”和“研磨后”中添加洗涤剂，有利于吸收和提取dna洗洁精中含有SDS(十二烷基磺酸钠),能够裂解细胞膜,利于DNA从细胞中释放;具有使蛋白质变性,与DNA分离作用,有利于提取DNA2.2在生物样品中添加1.4%的果汁蛋白酶能水解蛋白质,但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能耐受60~80℃的高温,而DNA在80℃以上才会变性。嫩肉粉中的木瓜蛋白酶的最适温度是55~60℃(pH3~9.5),如果在滤液中加入嫩肉粉,反应10~15min,嫩肉粉中的木瓜蛋白酶不仅能分解蛋白质,而且高温能使部分蛋白质变性,达到纯化DNA提取物的效果。在讨论的基础上,结合中学教材和实验室条件,对DNA释放和DNA纯化的步骤进行优化,实验器材进行简化(如广口瓶改为小烧杯、玻璃棒改为牙签等),试剂的量进行具体化。3优化实验,扩大了实验“纯度”1)制取香蕉研磨液。(1)取一段约2cm长的去皮香蕉,剪碎置于研钵中。(2)加入10mL温水、2g食盐和1~2滴(约0.1~0.2mL)厨房用洗洁精,研磨5~10min。(3)用双层纱布过滤研磨液,滤液于小烧杯中。2)粗提取DNA。(1)向滤液中加入2g嫩肉粉,轻摇小烧杯,让嫩肉粉和滤液充分接触。(2)把小烧杯置于60℃的水浴锅中加热10min。(3)待小烧杯冷却后,沿玻璃棒从烧杯壁缓慢加入2倍体积的95%的室温酒精(用室温的酒精代替冰酒精,析出的DNA的量无明显差异3)鉴定提取物。(1)取2支试管,分别编为1号、2号,各加入2mol/L的NaCl溶液5mL,将所得的白色粘稠物放入1号试管,搅拌使其溶解。(2)向2支试管中分别加入4mL新配置的二苯胺试剂,混匀,在沸水浴中加热10min。(3)待试管冷却后,观察颜色变化。这次,11个实验小组再次进行实验,全部成功:1号试管为清晰的蓝色,2号试管不变色(图3);学生还兴趣盎然地用双缩脲试剂对白色粘稠物进行检验,紫色和优化前相比变淡;定性说明实验设计优化后,白色粘稠物中蛋白质含量下降、而DNA的“纯度”明显提高了。整个实验研究的过程,不仅培养学生利用理论知识,提高了分析问题、解决问题的能力,感受书本知识的发展价值,而且养成严谨的科学态度和孜孜以求的科学精神,取得了很好的教学效果。实验材料:市售香蕉。实验试剂:(1)二苯胺试剂(无色)(A液:1.5g二苯胺溶于100mL冰醋酸中,再加1.5mL浓硫酸,棕色瓶保存;B液:0.2%的乙醛溶液;临