微藻毒素诱导克氏原螯虾血红蛋白释放的研究

微藻毒素诱导克氏原螯虾血红蛋白释放的研究

淡湖泊内的蓝色海藻洪水的发生频率和严重程度呈快速增长趋势，引起了全球生态灾害。无脊椎动物血细胞的吞噬作用是动物先天性细胞免疫的主要方式,一般而言,血细胞通过吞噬作用清除进入血淋巴中的病原体。在临床医学或实验室,为了检测实验动物的先天性免疫能力,通常会选择血细胞的吞噬指数作为衡量免疫力水平的指标。而为了快速、准确地检测血细胞的吞噬能力,选择一种效果明显、易观察的感染源十分必要。在研究吞噬作用中,不同学者采用不同的感染源。目前大部分的研究方法都是使用金黄色葡萄球菌、酵母细胞和酵母聚糖A等作为吞噬源,通过Gimesa染色,结合显微镜来评定血细胞吞噬外源异物的能力基于以上现状,本试验拟通过构建能表达EGFP的大肠杆菌作为吞噬源,结合荧光显微镜来检测克氏原螯虾血细胞的吞噬能力,进而评价被试动物机体的免疫能力。1材料和方法1.1试验材料质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司,E.coli菌株DH1.2测试方法1.2.1表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌结合刘利平挑取阳性单克隆菌落,在LB培养基中37℃下培养12～24h,达对数增长期后离心收集表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌,用磷酸盐缓冲液(PBS:137mmol/LNaCl,12.7mmol/LKCl,10mmol/LNa1.2.2克氏原生殖虾血淋垂培养参照魏静等1.2.3试验设计参照刘利平1.2.4外周血象的外周血一时采取不同外周血比例的平均外周血一时三法取15个视野为例(视野中的总细胞数超过100),在荧光倒置显微镜下,统计每个视野中的总血细胞数、参与吞噬作用的血细胞数以及具有吞噬作用的血细胞中被吞噬的大肠杆菌数目,将15个视野中各个指标累积,以下列公式分别计算血细胞的吞噬百分比及吞噬指数,统计结果采用SPSS13.0分析。2结果与分析2.1转换后，lb包括mp培养基的验证板DH2.2假阳性克隆的净化涂布于含Amp的LB平板上的细菌生成的单菌落中,有假阳性克隆的存在,即pEGFP并不是成功转入大肠杆菌,而是附着在大肠杆菌的表面。为避免假阳性克隆的干扰,需进一步的验证。随机挑取阳性单克隆菌落,在LB培养基中37℃培养12～24h,达对数增长期后离心收集表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌,用PBS漂洗3遍,以去除培养基,荧光倒置显微镜下经激发光照射、镜检。荧光显微镜下可以观察到大肠杆菌通体呈明亮的绿色荧光(图2,封二),说明pEGFP成功转入大肠杆菌体内,并稳定表达。该绿色荧光在激发光照射下不易淬灭。2.3荧光及荧光照射对克氏原螯虾有机分离的影响图3(封二)为激发光及可见光共同照射时荧光倒置显微镜下可见的克氏原螯虾血细胞对大肠杆菌的整个吞噬过程。经扫描电镜和显微镜观察,克氏原螯虾血细胞直径为5～10μm。图3A为在荧光及可见光照射下见到的能表达绿色荧光的大肠杆菌;图3B为荧光及可见光照射下见到的克氏原螯虾的血细胞;图3C、D为荧光及可见光照射下可见到的血细胞对大肠杆菌的粘连与聚集状态,图3C、D清晰可见表达绿色荧光的大肠杆菌粘连与聚集在血细胞周围;图3E、F为在荧光及可见光照射下可见到的血细胞对大肠杆菌的吞噬现象,其中图3E右下角处可以清晰地观察到5个被血细胞吞噬的能表达绿色荧光的大肠杆菌,图3F中可以观察到血细胞吞噬了4个能表达绿色荧光的大肠杆菌。2.4mc和甲醇联合处理作用后外周血红细胞感染情况各试验组之间吞噬百分比的统计结果(图4)并没有显著性差异,甲醇(空白组)作用后,血细胞的吞噬百分比和对照组相比有上升的趋势;MC和甲醇联合(处理组1、2、3、4)作用后,血细胞的吞噬百分比与对照组相比有下降的趋势,并存在一定的剂量效应。吞噬指数的统计结果(图5)表明,MC作用后,对照组与空白组、4个处理组均有显著性差异;其中对照组与处理组1、处理组2和处理组3的差异极显著,而空白组和4个处理组间没有显著性差异,各处理组之间均没有显著性差异。3mc的联合作用血细胞在无脊椎动物免疫中起着重要的作用,它既是细胞免疫的主要参与者,也是多种体液免疫的载体。吞噬作用是指细胞把入侵的病原体(如细菌和病毒))转运到细胞内并加以清除的过程,此过程构成了生物体先天免疫的第一道防线虾类的免疫功能主要是通过血细胞来完成的,它既是免疫细胞的担当者,又是体液免疫的提供者。根据有无颗粒、颗粒多少及颗粒大小为依据可以将虾血细胞分为透明细胞、小颗粒细胞和颗粒细胞目前认为虾类免疫主要包括血细胞的吞噬、包裹、凝集和溶菌活性以及血淋巴中的免疫应答因子,其免疫过程可能为:当外界异物侵袭机体时,异物表面的分子作用于宿主的半颗粒细胞,细胞受体与“非己”分子结合,刺激细胞产生胞吐作用进行脱颗粒,把酚氧化酶原系统释放到周围介质中。随后酚氧化酶被激活,活化过程中产生一系列的活性物质,促进血细胞的吞噬、介导凝集和凝固,产生杀菌物质,从而消除入侵的病原和外来异物本试验结果表明,MC作用后各组之间吞噬百分比并没有显著性差异,这可能与各类细胞在免疫应答反应所起的作用有关,颗粒细胞并不参与吞噬作用,MC作用后可能并没有改变各类细胞在免疫应答反应中的功能。MC和甲醇联合作用后,克氏原螯虾血细胞吞噬指数显著降低,抑制血细胞识别异物和吞噬包囊的功能;吞噬指数与MC的浓度存在剂量效应,MC浓度只有1μg/L时,吞噬指数百分比最低、仅为1.37225;而当MC浓度达到1000μg/L时,吞噬指数有所升高。随着MC暴露时间的延长,血细胞损伤严重。试验中发现,吞噬时间过久,有必要缩短吞噬时间;12h(1μg/L)作用后,用PBS冲洗平板,视野中的细胞数量极少,且视野中的细胞基本都为透明细胞,可见的细胞中充满大肠杆菌。这可能是因为MC的毒性比较强,导致血细胞大量死亡或者是血细胞的贴壁作用减弱,PBS一冲就全部脱落。随着MC浓度的升高,克