小鼠粪便细菌基因组dna提取方法的比较

小鼠粪便细菌基因组dna提取方法的比较

肠道是动物体内最大的消化器官，其中包含大量的细菌细菌，形成极其复杂的细菌微生态系统。肠道微生态系统中动物群体的结构、数量和类型的变化与身体的健康和疾病密切相关。粪便的主要成分是微生物的菌体和食物残渣,其中包含着重要的肠道微生物信息,可以间接地反映肠道微生物的变化情况。近年来随着分子生物学研究和技术的发展,利用分子生物学技术和方法从粪便中提取肠道微生物总DNA,并对相关疾病进行研究取得了许多突破本研究是在已有报道的基础上比较几种小鼠粪便细菌基因组DNA提取方法,旨在保证提取效率的同时得到高质量的细菌基因组DNA,为肠道微生态系的研究提供实验基础。1细菌基因组dna提取样品的采集与储存:BALB/C清洁级小鼠由首都医科大学动物中心提供,3周龄,体重18~22g,直接从小鼠肛门处收集粪便于1.5mL的无菌管中,放入-80℃保存,备用。试剂:三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE,国产);十二烷基磺酸钠(SDS,国产);核糖核酸酶A(RNaseA,Promega公司);蛋白酶K(Promega公司);氯化钠(NaCL,国产);十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,国产);氯仿(国产分析纯);异丙醇(国产分析纯);Tris酚(国产);异戊醇(国产分析纯);无水乙醇(国产分析纯);λDNA/HindⅢDNAMarker(TIAN-GEN公司);100bpDNAladderMarker(TIANGEN公司);Gel-Red核酸染料(Sigma公司);琼脂糖(Sigma公司);荧光定量PCR试剂盒(ABI公司);引物(上海生工生物工程技术服务有限公司合成);粪便细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型TIANampStoolDNAKit,TIANGEN公司)。仪器:Q5Real-timePCR扩增仪(ABI公司);电泳仪(Bio-Rad公司);高速冷冻离心机(Eppendorf公司);NanoDrop2000紫外分光光度仪(Thermo公司);凝胶成像分析系统(VILBERLOURMA公司);漩涡混合器(国产);电热恒温水浴锅(国产)。2实验方法2.1蒸清、煮清、水煮方法1———研磨:称取0.1g小鼠粪便放入灭菌研钵中,在冰上彻底研碎,然后加入1mL无菌双蒸水彻底重悬,10000r/min、离心10min,取上清待用。方法2———水煮:在0.1g小鼠粪便中加入1mL无菌双蒸水于1.5mL的EP管中,浸泡10min后充分振荡摇匀15s;将管放置100℃水浴10min;冷却后10000r/min、离心10min,取上清待用。2.2te缓冲液tab/ncl(1)改良CTAB方法:参照文献[6](有改动),分别在预处理过的500μL样品中加入30μL、10%SDS,3μL蛋白酶K(20g/L),4μLRNaseA后混匀,37℃水浴1h;每管中加入100μLNaCL(5mol/L),颠倒混匀后加入80μL的CTAB/NaCL(10%CTAB,0.7mol/LNaCL),轻轻混匀;放入65℃水浴10min;加入等体积酚/氯仿/异戊醇(比例为25∶24∶1)混合液,混匀后12000r/min、离心10min,取上清;上清液中加入0.6倍体积的异丙醇,轻轻混匀,12000r/min、离心10min,弃上清;沉淀用1mL预冷的75%乙醇洗涤后,7500r/min离心5min,弃乙醇,在洁净工作台中稍加干燥,溶于30μLTE缓冲液中。(2)试剂盒方法:将预处理好的样品,分别按照粪便细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)说明书的步骤进行提取。2.3大鼠粪便细菌群的dna质量分析2.3.1细菌组的dna纯度和浓度的测量分别取2μL提取到的细菌基因组DNA,在NanoDrop2000紫外分光光度仪上检测DNA的质量浓度及DNA的A2.3.2琼脂糖凝胶电泳分别取5μL提取到的DNA于含Gel-Red核酸染料的0.8%琼脂糖凝胶中电泳,工作电压120V,50min后置于凝胶成像分析系统中观察、分析结果。2.3.3荧光定量pcr反应使用细菌16SrDNA基因V3区特异性引物338-F:5’-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’,548-R:5’-AATACGGAGGGTGCAAGCGT-3’,以提取到的小鼠粪便细菌基因组DNA为模板,进行细菌16SrDNA基因荧光定量PCR扩增,每个样本设置3次重复,同时设置不添加模板的阴性对照组。根据PowerSYBRGreenmastermix说明书配置荧光定量PCR反应体系20μL。反应条件:95℃、10min,95℃、15s,58℃、30s、72℃,30s,40个循环;反应完成后利用熔解曲线分析产物的特异性,观察其扩增曲线以及记录Ct值(反应管内的荧光信号到达设定值时所经历的循环数);扩增产物在含Gel-Red核酸染料的1%琼脂糖凝胶中电泳(电压100V,50min),结果于凝胶成像分析系统中观察、分析。2.4统计分析采用SPSS22.0统计软件,对数据进行单因素方差分析。3结果3.1不同水煮法和研磨法提取dna的比较结果见表1。由表1可知:采用相同预处理方法的样本,改良CTAB法提取到的DNA质量浓度c(DNA)明显高于试剂盒法提取到的;对于采用相同的提取方法、不同预处理方法的样本提取到的DNA质量浓度不同,与水煮法相比,研磨法能显著提高小鼠粪便细菌基因组的c(DNA);不同方法提取到的细菌基因组DNA质量浓度之间的差异有统计学意义(P<0.01)。A3.2小鼠粪便细菌基因组dna条带的提取通过琼脂糖凝胶电泳图(见图1)可见:不同方法提取到的DNA均在23kb左右处有清晰条带;相同预处理方法的样品,改良CTAB法提取到的小鼠粪便细菌基因组DNA条带较亮;采用相同DNA提取方法,水煮法预处理过的样本提取到的细菌基因组DNA有明显的拖带,说明提取到的DNA发生了降解,DNA分子的完整性变差。3.3荧光定量pcr检测细菌16srdna基因序列利用不同方法提取到的粪便细菌基因组DNA为模板,采用相同DNA模板量对细菌16SrDNA基因进行荧光定量PCR扩增。PCR扩增的溶解曲线上显示每个样品扩增的16SrDNA基因均为单一峰,特异性较好(见图2)。图3的PCR扩增曲线显示:以研磨结合改良CTAB法提取到的DNA为模板扩增细菌16SrDNA基因得到的Ct值最低,与水煮结合改良CTAB法提取到的DNA扩增得到的Ct值相比有统计学意义(P<0.05),具体结果见表2。对荧光定量PCR的扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测表明:扩增产物均可以在200bp左右看到细菌16SrDNA基因的特异性扩增片段,且无干扰性杂带,重复性好(见图4);研磨结合CTAB法获得的DNA扩增产物条带最亮;经过水煮法预处理的样品,不同提取方法提取到的DNA扩增后的产物条带均较暗,说明经过水煮预处理的样品提取到的细菌基因组DNA浓度较低,质量较差。4不同方法提取的细菌基因组dna从粪便中有效地提取到高质量的细菌基因组DNA是研究肠道微生态的基础和前提。目前,从粪便标本中提取细菌DNA的方法众多,由于提取机理和步骤的差别,获得DNA的浓度和纯度各不相同,导致在后续实验,如PCR扩增、DNA测序等的应用效果不同本实验的实验结果显示:经过不同预处理的样本,采用相同的细菌基因组DNA提取方法提取到的DNA质量浓度不同,研磨预处理后提取到的细菌基因组DNA质量浓度明显高于经水煮后提取到的DNA质量浓度。有文献报道机械破壁对厚壁菌门的破壁效果要优于传统的酶解作用水煮法是利用物理方法处理蛋白质,使其与核酸分离,但是在加热过程中菌体破裂的比例较小,而且煮沸过程中部分DNA发生降解此外细菌16SrDNA基因荧光定量PCR扩增结果显示,经过水煮法预处理过的样品,提取到的DNA完整性较研磨预处理后提取到的DNA差。已有的研究法发现把经过相同预处理的样本,采用不同提取方法提取到的细菌基因组DNA进行综合比较发现:改良CTAB方法提取到的DNA质量浓度明显高于试剂盒法提取到的DNA质量浓度;改良CTAB方法的DNA纯度低于试剂盒法提取到的DNA纯度。试剂盒的方法操作简单、用时短,提取到的DNA质量稳定,但是荧光定量PCR的扩增效果比改良CTAB法的差,而且试剂盒价格较贵,使用次数有限,试剂盒的质量因不同厂家和批次也会有所差异,不适合大量样本的粪便细菌基因组DNA的提取。改良的CTAB方法提取到的细菌基因组DNA条带完整、较亮,没有明显的降解和蛋白质污染;以此为模板进行细菌16SrDNA基因荧光定量PCR扩增,扩增产物条带清晰,说明改良的