水凝胶携带肾素抑制剂阿利吉仑抑制心肌梗死后大鼠心室重构的实验研究

水凝胶携带肾素抑制剂阿利吉仑抑制心肌梗死后大鼠心室重构的实验研究

0raas活性急性心脏病（ami）后，肾素-血管紧张素-黄酮（raas）激活。raas激活后，诱导炎症反应、细胞增生和钙化，以调节活性物质的遗传出现，激活各种细胞的外部消息通道，均与心肌梗死后心肠组织的恢复和重建有关。葡聚糖-聚己内酯-甲基丙烯酸羟乙酯共聚N-异丙基丙烯酰胺[Dextran-poly(e-caprolac-tone)-hydroxylethylmethacrylate/poly(N-isopropylacrylamide),Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm]水凝胶是一种人工合成的可降解的温度敏感性生物材料。这种新型的高分子材料具有良好的生物相容性,前期试验证明了这种温度敏感性水凝胶注入体内后不具有生物毒性1大鼠心肌梗死超早期感染的检测1.1实验动物70只4周龄雄性大鼠,平均体重160~180g,购自武汉大学实验动物中心,分笼饲养。1.2实验药物阿利吉仑购自大连美仑公司,水凝胶由武汉大学高分子实验室提供;基质金属蛋白酶-2(Matrixmetalloproteinases-2,MMP-2)、MMP-9、基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-1(Tissueinhibitormetalloproteinase,TIMPs)抗体购自santa公司;转化生长因子(Transforminggrowthfactorβ,TGF-β)抗体购自abcam公司;GAPDH抗体购自杭州贤至生物有限公司。1.3心梗模型的建立将70只大鼠随机分成5组:假手术组(Sham组)、模型对照组(磷酸缓冲液组即Pbs组)、水凝胶组(Gel组)、Pbs携带阿利吉仑组(Pbs+a组)、温度敏感型水凝胶携带阿利吉仑组(Gel+a组),各组经腹腔注射2%的戊巴比妥钠(20mg/kg)麻醉后,气管插管,正中开胸,暴露心脏后,在左前降支(LAD)近端穿线并结扎,Ⅱ导联出现ST段和(或)T波抬高或降低、结扎线以下心肌颜色变暗为结扎成功。其中假手术组只将缝线穿过冠状动脉不结扎,其余各组在结扎成功后,分别在梗死周边区的4个点注入以下药物,Pbs组:注射75μLPbs溶液;Gel组:注射浓度为1.5%的75μL水凝胶;Pbs+a组:注射75μL含有1.5mg阿利吉仑的Pbs溶液;Gel+a组:注射含有1.5mg阿利吉仑的浓度为1.5%75μL水凝胶。术后注射3d青霉素(50万IU/d)预防感染。1.4检测指标1.4.1注射过量戊巴比妥钠(200mg/kg)处死实验鼠,随后取出心脏,并用肝素化生理盐水灌洗心脏并分离左心室,每个心脏的一部分用4%多聚甲醛固定48h,用石蜡包埋,在梗死部位垂直于长轴横向进行心脏切片,厚度4μm,每个样本在不同层面取3张切片作为代表。行HE染色、改良Masson三色染色,显微镜下观察梗死部位左心室的形态及水凝胶残余情况。采用ImageProPlus6.0多媒体彩色病理图像分析软件测量梗死区面积,并计算梗死百分比。梗死百分比=梗死面积/左室总面积×100%。应用ImageProPlus6.0多媒体彩色病理图像分析软件系统拍照,通过灰度调节区分胶原和非胶原成分,Masson染色组织中蓝色为阳性胶原。并进行分析测定,计算心肌胶原含量百分比,即胶原容积分数(Collagenvolumefraction,CVF:心肌胶原面积/所测同视野组织总面积,每张切片随机选取10个不重复的视野,取平均值)。大鼠处死后取心肌梗死周边区的组织,提取组织蛋白后,采用SDS电泳分析MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TGF-β蛋白的表达。2各组大鼠心肌组织病理学指标比较70只大鼠用于本实验,手术过程中死亡7只,造模成功后存活56只,其中假手术组8只,Pbs组、Gel组、Pbs+a组各存活11、12、12只,Gel+a组13只。手术前后各组间相比,大鼠体重未见明显差异(表1)。2.1心肌梗死面积分析用ImageProPlus6.0多媒体彩色病理图像分析软件分析心肌梗死后发现,与假手术组比较,Pbs组、Gel组、Pbs+a组、Gel+a组的心梗面积明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);与Pbs组比较,Gel组、Gel+a组的梗死面积明显减小,差异有统计学意义(P<0.01),提示注射Gel及Gel携带阿利吉仑的治疗,有利于改善心肌重构,而Pbs+a组与Pbs组相比,差异无统计学意义(P=0.72),由于药物在体内无法达到有效的浓度;与单纯Gel组比较,Gel+a组的心梗面积明显减小,差异有统计学意义(P<0.01)(见表2、图1)。2.2胶原容积分数分析Masson染色后的心肌组织胶原部分为蓝色,正常心肌组织显红色,显微镜下观察,假手术组无胶原增生,心肌细胞及胶原排列整齐,其余各组均可见明显胶原增生、断裂,排列紊乱(图2)。用ImageProPlus6.0多媒体彩色病理图像分析软件分析胶原容积分数后发现,与假手术组比较,Pbs组、Gel组、Pbs+a组、Gel+组的CVF明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);Gel组、Gel+a组较Pbs组CVF明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);提示Gel及Gel携带阿利吉仑的治疗有减少胶原沉积的作用而Pbs+a组与Pbs比较,差异无统计学意义(P=0.76),Pbs不具有缓释的作用,所以阿利吉仑在体内无法达到有效的药物浓度,无法起到治疗作用;与单纯Gel组比较,Gel+a组的CVF下降更加明显,差异有统计学意义(P<0.05)(表3),说明水凝胶携带阿利吉仑能够更好地抑制胶原的沉积。2.3Westernblot检测蛋白的表达与假手术组比较,Pbs组、Gel组、Pbs+a组、Gel+a组的MMP-2、MMP-9、TGF-β蛋白的表达明显升高(P<0.05),TIMP-1蛋白水平降低。与Pbs组比较,Gel组、Gel+a组的MMP-2、MMP-9、TGF-β蛋白的表达明显降低(P<0.05),TIMP-1的表达较Pbs组明显升高,而Pbs+a组与Pbs组相比,各蛋白表达无明显差异(P=0.723),Gel+a组与单纯Gel组比较,MMP-2、MMP-9、TGF-β蛋白的表达明显降低,而TIMP-1蛋白的表达升高(表4、图3、图4)。3gel和pbs对心肌重构的影响心肌梗死发生以后,伴随一系列复杂的病理生理变化,包括心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及细胞外基质的变化,梗死部位的疤痕修复,心肌间质的纤维化,导致左室腔的大小、厚度和形态发生改变,这些改变总称为左室重构(Ventricularremodeling,VR)[8]。心室重构不但影响心肌梗死后急性期的心功能状态,而且是决定急性心肌梗死后心脏事件发生率和远期预后的主要因素胶原是细胞外基质的主要成分,约占细胞外基质的85%。心肌胶原网络结构的主要功能是为心肌细胞提供支持框架,维持心室的几何形态,决定心室顺应性。间质胶原正常情况下处于合成与降解动态平衡,随着年龄的增长,胶原合成多于降解,胶原沉积增加;在某些病理状态下,如MI、高血压、心肌炎、心肌病等,心肌胶原分泌增加,但胶原纤维间连接减少,而继发心力衰竭时胶原纤维在心肌细胞间过多地累积,即发生替代性纤维化,胶原和纤连蛋白等ECM组分增加,心肌僵硬性增加,顺应性降低,收缩和舒张功能障碍本研究发现,各个实验组与Sham组比较,心肌梗死面积和胶原容积百分比均明显升高,说明各实验组心肌均发生了心室重构。其中Gel组与Pbs组比较,心梗面积和胶原容积百分比均明显减小,提示在梗死周边区注射水凝胶可以抑制心肌梗死后心室重构,这与以前的研究结果一致基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases,MMPs)由巨噬细胞分泌,其主要作用是降解细胞外基质,目前已经发现大概有20多种,而其中与心室重构关系密切的是MMP-2和MMP-9。Peterson等本实验也证实,与Sham组比较,MMP-2和MMP-9的蛋白表达升高,与既往的研究结果一致;而与Pbs组比较,干预组Gel组和Gel+a组的MMP-2和MMP-9的含量明显降低,提示Gel及Gel+a可以抑制心梗大鼠的MMP-2和MMP-9的过表达,与单纯的Gel组比较,Gel+a组的MMP-2和MMP-9的含量降低更加明显,这也提示水凝胶携带阿利吉仑能够通过抑制MMP-2和MMP-9的表达来改善心肌重构。MMPs的内源抑制物主要是TIMPs。MMPs的过度激活能导致MMPs/TIMP比例失调,而MMPs/TIMP比例失衡是导致心室重构和心肌纤维化的重要原因。在人体内TIMPs主要有4种,其中TIMP-1能抑制包括MMP-2及MMP-9在内的大多数MMPs。既往研究发现,心衰患者的MMP-2、MMP-9明显升高,TIMP-1则降低,胶原代谢活跃,但是给予相关的抗心衰药物治疗后,随着MMP-2、MMP-9的相应下降及TIMP-1的升高,心室重构及心功能也得到改善本研究中也证实了与Sham组相比,各实验组的TIMP-1降低,而与Pbs组比较,Gel组和Gel+a组的TIMP-1明显升高;而Gel组和Gel+a组比较,后者心肌组织中TIMP-1含量升高更明显,提示水凝胶携带阿利吉仑能通过调节MMPs/TIMP的比例平衡而改善心肌梗死后心室重构的作用。转化生长因子(Transforminggrowthfactor-β,TGF-β)具有双向的作用,一方面对心脏有保护作用;另一方面,TGF-β可以促进内皮细胞和成纤维细胞的增殖,提高心肌组织内纤维粘连蛋白和胶原的表达,降低Ca本实验研究发现,在各个实验组,TGF-β明显升高,这也证明了各实验组存在明显的心室重构。但与Pbs组比较,Gel组和Gel+a组的TGF-β明显下降;Gel组与Gel+a组相比,Gel+a组的TGF-β下降更加明显;水凝胶携带阿利吉仑能通过抑制TGF-β的过表达来抑制心室重构。目前,随着