基因工程的基本工具专家讲座

乳汁中含有些人生长激素转基因牛(阿根廷)转鱼抗寒基因番茄基因工程的基本工具专家讲座第1页转基因抗虫棉抗虫棉普通棉基因工程的基本工具专家讲座第2页专题一基因工程基因工程的基本工具专家讲座第3页DNA重组技术基本工具基因工程的基本工具专家讲座第4页基因工程概念基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗地说，就是按照人们意愿，把一个生物某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一个生物细胞里，定向地改造生物遗传性状。基因工程的基本工具专家讲座第5页基因工程别名操作环境操作对象操作水平基本过程实质结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要基因产物剪切→拼接→导入→表示基因重组基因工程概念基因工程的基本工具专家讲座第6页基因工程培育抗虫棉简明过程：普通棉花(无抗虫特征)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因与载体DNA拼接导入棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特征)上述培育抗虫棉关键步骤是什么？基因工程的基本工具专家讲座第7页基因工程培育抗虫棉关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与载体DNA连接关键步骤三：抗虫基因导入受体(棉花)细胞基因工程的基本工具专家讲座第8页处理培育抗虫棉关键步骤需要哪些工具？关键步骤一工具：关键步骤二工具：关键步骤三工具：基因剪刀——限制酶基因针线——DNA连接酶基因运载工具——载体基因工程的基本工具专家讲座第9页DNA重组技术基本工具本节知识内容§1DNA重组技术基本工具专题一基因工程“分子手术刀”──限制酶

“分子缝合针”──DNA连接酶

“分子运输车”──基因进入受体细胞载体

基因工程的基本工具专家讲座第10页限制性内切酶作用过程基因工程的基本工具专家讲座第11页识别双链DNA分子某种特定核苷酸序列，而且使每一条链中特定部位两个核苷酸之间磷酸二酯键断开。主要是从原核生物中分离纯化出来一个酶。能将外来DNA切断，因为这种切割作用是在DNA分子内部进行，故名限制性核酸内切酶。4000种。1、起源：2、种类：3、作用：4、结果：形成两种末端一、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶粘性末端平末端基因工程的基本工具专家讲座第12页黏性末端黏性末端限制性核酸内切酶EcoRI基因工程的基本工具专家讲座第13页大肠杆菌(E.coli)一个限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。限制酶什么叫黏性末端？基因工程的基本工具专家讲座第14页限制酶什么叫黏性末端？基因工程的基本工具专家讲座第15页什么叫黏性末端？被限制酶切开DNA两条单链切口，带有几个伸出核苷酸，他们之间恰好互补配对，这么切口叫黏性末端。基因工程的基本工具专家讲座第16页基因工程的基本工具专家讲座第17页什么叫平末端？当限制酶从识别序列中心轴线处切开时，切开DNA两条单链切口，是平整，这么切口叫平末端。基因工程的基本工具专家讲座第18页二、“分子缝合针”——DNA连接酶1、种类：2、作用部位：两类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶

磷酸二酯键

DNA连接酶可把黏性末端之间缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手断口连接起来，这么一个重组DNA分子就形成了。基因工程的基本工具专家讲座第19页DNA连接酶作用过程基因工程的基本工具专家讲座第20页3、区分：E.coliDNA连接酶连接黏性末端T4DNA连接酶既能连接黏性末端，又能够连接平末端（效率低）基因工程的基本工具专家讲座第21页基因工程的基本工具专家讲座第22页T磷酸二酯键1234512345A基因工程的基本工具专家讲座第23页基因工程的基本工具专家讲座第24页

DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为何？答：不是一回事。基因工程中所用连接酶有两种：一个是从大肠杆菌中分离得到，称之为E·coli连接酶。另一个是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA缺口（nick），而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸3位碳原子上羟基与5位碳原子上所连磷酸基团羟基之间形成），那么，二者差异主要表现在什么地方呢？基因工程的基本工具专家讲座第25页（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已经有核酸片段末端上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸经过磷酸二酯键形成一条与模板链互补DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上两个缺口同时连接起来。所以DNA连接酶不需要模板。另外，二者即使都是由蛋白质组成酶，但组成和性质各不相同。基因工程的基本工具专家讲座第26页三、“分子运输车”—基因进入受体细胞载体：基因工程的基本工具专家讲座第27页外源基因(胰岛素基因)怎样才能导入受体细胞(大肠杆菌)？导入过程需要运输工具——载体。载体作用有哪些？作用一：作为运载工具，将外源基因(胰岛素基因)转移到受体细胞(大肠杆菌)中去。作用二：利用载体在受体细胞(大肠杆菌)内，对外源基因(胰岛素基因)进行大量复制。基因工程的基本工具专家讲座第28页作为载体必须具备哪些条件？1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保留。2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）含有一些标识基因，便于进行筛选。如抗菌素抗性基因、产物含有颜色反应基因等。基因工程的基本工具专家讲座第29页惯用载体主要有两类：1）细菌细胞质质粒2）噬菌体或一些动植物病毒基因工程的基本工具专家讲座第30页基因工程“专用工具”运载体：常用质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒质粒特点：1、细菌拟核外双链环状DNA分子2、能自我复制并在受体细胞中稳定存在3、有一个或多个限制酶切点4、有特殊标识基因基因工程的基本工具专家讲座第31页练习答案基因工程的基本工具专家讲座第32页2和7能连接形成…ACGT…

…TGCA…；4和8能连接形成…GAATTC…

…CTTAAG…；3和6能连接形成…GCGC…

…CGCG…；1和5能连接形成…CTGCAG…

…GACGTC…。基因工程的基本工具专家讲座第33页迄今为止，基因工程中使用限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来，它们各自能够识别和切断DNA上特定碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断本身DNA，是因为微生物在长久进化过程中形成了一套完善防御机制，对于外源入侵DNA能够降解掉。生物在长久演化过程中，含有某种限制酶细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶识别切割序列，或者经过甲基化酶将甲基转移到所识别序列碱基上，使限制酶不能将其切开。这么，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使本身DNA被切断，而且能够预防外源DNA入侵基因工程的基本工具专家讲座第34页基因工程中作为载体使用DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外一个能够自我复制、双链闭环裸露DNA分子。是否任何质粒都能够作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用载体必需满足以下条件。（1）载体DNA必需有一个或多个限制酶切割位点，方便目标基因能够插入到载体上去。这些供目标基因插入限制酶切点所处位置，还必须是在质粒本身需要基因片段之外，这么才不至于因目标基因插入而失活。（2）载体DNA必需具备自我复制能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA复制而同时复制。（3）载体DNA必需带有标识基因，方便重组后进行重组子筛选。（4）载体DNA必需是安全，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外其它生物细胞中去。（5）载体DNA分子大小应适合，方便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。基因工程的基本工具专家讲座第35页书本知识回顾

基因工程又叫做

或

。通俗地说，就是按照人们意愿，把一个生物某种

提取出来，加以

，然后放到另一个生物细胞里，

改造生物遗传性状。基因拼接技术DNA重组技术基因修饰改造定向地基因工程的基本工具专家讲座第36页DNA重组技术基本工具“分子手术刀”──“分子缝合针”──“分子运输车”──限制酶DNA连接酶基因进入受体细胞载体基因工程的基本工具专家讲座第37页限制性核酸内切酶主要是从一个酶。识别双链DNA分子某种