生物免疫分析技术专家讲座

第四章生物免疫分析技术生物免疫分析技术专家讲座第1页免疫学方法在食品分析中正得到越来越广泛利用，其中酶联免疫吸附法（ELISA）已经在食品工业中广泛应用，它能够用于测定人们希望含有物质，以及不希望含有物质。比如现在人们所关注食品安全性问题中一些物质检测：杀虫剂、药品残留物、激素、生长素、微生物毒素、真菌毒素或肠毒素、天然毒素，以及一些添加剂。免疫分析法具备有效灵敏度、特异性、快速和低成本优点；可对大量样品进行常规分析；能够用于样品定性筛选，也能够对样品进行定量测定以确定样品中待测组分含量。生物免疫分析技术专家讲座第2页4.1免疫原理Ag+AbAg－Ab特异性、灵敏性在Ag，Ab反应中，用轻易示踪化学物质标识一个反应物，以了解反应是否发生，发生部位，以及发生程度（即对未知成份样品进行定性、定位及定量分析）。生物免疫分析技术专家讲座第3页4.2酶联免疫法免疫酶技术：把抗原抗体免疫反应和酶高效催化作用原理有机地结合起来。它含有免疫荧光试验和放射免疫试验优点，并克服上述两种方法缺点。酶标识试剂制备轻易、稳定、使用期长，免疫酶技术敏感性靠近放射免疫试验，可直接肉眼观察也可借助简单仪器作定量测定，所得结果比较客观。生物免疫分析技术专家讲座第4页酶免疫测定或免疫酶技术是指酶标识抗体或酶标识抗体进行抗原抗体反应。它主要包含两个方面：免疫过氧化物酶法：以过氧化物酶作为标识，与抗原或抗体结合，然后依据酶与其底物间所产生不溶性颜色产物，借助于光学或电子显微镜观察细胞及亚细胞水平抗原或抗体。酶联免疫吸附法：依据可溶性抗原或抗体与不溶性固相载体结合后，还保留其免疫活性，结合了作为标识酶催化作用。生物免疫分析技术专家讲座第5页ELISA基本原理和方法ELISA种类和改变ELISA特点ELISA应用实例ELISA生物免疫分析技术专家讲座第6页4.2.1基本原理它采取抗原与抗体特异反应将待测物与酶连接，然后经过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定对象能够是抗体也能够是抗原。在这种测定方法中有3种必要试剂：①固相抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标识抗原或抗体（标识物）③酶作用底物（显色剂）生物免疫分析技术专家讲座第7页测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一个抗体（抗原）与酶结合成偶联物（标识物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上抗原（抗体）反应结合后，再加上酶对应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。生物免疫分析技术专家讲座第8页颜色反应深浅与对应抗体或抗原量成正比，所以可借助于颜色反应深浅来定量抗体或抗原。

这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也能够用分光光度计（酶标仪）加以测定。

其方法简单，方便快速，特异性强。生物免疫分析技术专家讲座第9页4.2.2酶及其底物

酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结产物。是ELISA成败关键试剂，它不但含有抗体抗原特异免疫反应，还含有酶促反应，显示出生物放大作用，但不一样酶选取不一样底物，将得到不一样颜色反应。生物免疫分析技术专家讲座第10页酶底物显色反应

测定波长

辣根过氧化物酶邻苯二胺

四甲替联苯胺

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492460449

425

642

碱性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶

甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色

360,450

420

生物免疫分析技术专家讲座第11页4.2.3ELISA种类和改变

（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（四）双位点一步法（五）捕捉法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素ELISA

生物免疫分析技术专家讲座第12页（一）双抗体夹心法此法适合用于检验各种蛋白质等大分子抗原生物免疫分析技术专家讲座第13页步骤：A将已知抗体吸附于载体上，温育后清洗；B加入待检标本溶液，使溶液中抗原与吸附抗体结合，温育后清洗；C加入酶标识特异性抗体，温育后清洗；D加入酶作用底物，产生显色反应，颜色改变与所加待检标本溶液中抗原量成正比。生物免疫分析技术专家讲座第14页间接法是检测抗体最惯用方法，其原理为利用酶标识抗抗体以检测已与固相结合受检抗体，故称为间接法。（二）间接法生物免疫分析技术专家讲座第15页步骤：A将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），经温育后清洗；B加入待检稀释血清，若血清中有对应特异性抗体存在则与吸附抗原结合，温育后清洗；C加入酶标识抗球蛋白抗体，此时酶标识抗抗体与吸附抗原抗体复合物结合，温育后清洗；D加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用光电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。生物免疫分析技术专家讲座第16页（三）竞争法

此法可用于检测小分子抗原。生物免疫分析技术专家讲座第17页步骤：A将已知抗体吸附于固相载体表面，温育后清洗；B将可能含抗原待检溶液和酶标识已知抗原溶液以适当百分比混合，加入已包被载体孔中，温育后清洗；C加入酶作用底物，产生显色反应。色深表示结合酶标识抗原多，而待检溶液中未标识抗原量少；反之，色浅表示结合酶标识抗原少，而待检溶液中抗原量多。生物免疫分析技术专家讲座第18页对照管因为只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合酶标抗原量降低。所以，加入底物后显色反应较弱。生物免疫分析技术专家讲座第19页4.2.4特点特点一：灵敏性该测定法灵敏度来自酶。众所周知,酶是一个有机催化剂，极少许酶即可诱导大量催化反应，产生可供观察显色反应现象。所以该体系常被称为酶放大致系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。比如，在测定血清中某一物质含量时，化学比色法敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法敏感度约为5～10μg/ml。生物免疫分析技术专家讲座第20页特点二：特异性其特异性来自抗体或抗原选择性。抗原抗体结合实质上只发生在抗原抗原决定簇与抗体抗原结合位点之间。因为二者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应含有高度特异性。

生物免疫分析技术专家讲座第21页比如乙肝病毒中表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和关键抗体（HBcAg），虽起源于同一病毒，但仅与其对应抗体结合，而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应这种特异性使免疫测定能在一非常复杂蛋白质化合物（比如血清）中测定某一特定物质，而不需先分离待检物。生物免疫分析技术专家讲座第22页ELISA应用实例生物免疫分析技术专家讲座第23页饲料中盐酸克伦特罗测定饲料中毒素测定（主要包含黄曲霉毒素，简曲霉毒素）饲料中有害微生物快速筛检（如沙门氏菌）甲胺磷残留分析甲基对硫磷残留分析呋喃丹残留分析ELISA在饲料安全检测中应用ELISA用于农药残留检测生物免疫分析技术专家讲座第24页河豚毒素

植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素苯并芘

主要有除草剂与杀虫剂两大类比如杀暝松（FN）、甲氟磷酸异已酶（SOMAN）、草不绿（Alachor）、西维因（Carbaryl）、多菌灵及克菌丹（Captan）等。农药检测：生物免疫分析技术专家讲座第25页ELISA检测“非经典肺炎”冠状病毒ELISA在结缔组织病早期诊疗中应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/类风湿性关节炎（PtA）33抗体ELISA在疾病诊疗中作用ELISA法检测幽门螺杆菌抗体生物免疫分析技术专家讲座第26页ELISA试剂盒商业资讯生物免疫分析技术专家讲座第27页ELISA试剂盒生物免疫分析技术专家讲座第28页生物免疫分析技术专家讲座第29页酶联免疫井生物免疫分析技术专家讲座第30页DNM-9602G酶标分析仪DNM-9602标配酶标分析仪

DNM-9602A酶标分析仪几个酶标分析仪生物免疫分析技术专家讲座第31页4.3放射免疫法放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）是1959年由Berson和Yalow首先用于糖尿病患者胰岛素含量测定，是一个将同位素分析灵敏性和抗原抗体反应特异性这两大特点结合起来免疫标识测定技术。其优点是灵敏度高、特异性强、准确性好、样品用量少，而且不需要复杂提纯步骤。缺点是需要特殊仪器设备和一定防护条件，而且有些同位素标识物半衰期较短以及试验废物难以处理，对环境造成放射性污染。生物免疫分析技术专家讲座第32页放射免疫测定法基本原理放射免疫测定是建立在待测抗原和标识抗原对有限量抗体进行竞争性结合基础上。待测抗原是指人体内某种微量活性物质（如微生物＆寄生虫抗原、激素、维生素、酶、药品等），而标识抗原使将已知上述物质标识上放射性同位素，含有示踪作用。生物免疫分析技术专家讲座第33页将标识抗原（Ag*）和未标识抗原（Ag）与特异性抗体（Ab）相混合，结果形成标识和未标识抗原抗体复合物。标识和未标识抗原竞争与抗体进行结合现象，成为竞争性抑制作用。

Ag*+AbAg*-Ab

标识抗原

特异性抗体

标识抗原抗体复合物+