微生物学医学知识讲座

显微镜放大法——细菌形体微小，肉眼不能直接看到，必须借助显微镜（普通光学显微镜、电子显微镜）放大后才能观察。染色检验法——细菌体小,半透明，经染色后才能观察较清楚。微生物学医学知识讲座第1页普通光学显微镜分辨率为0.25um。普通细菌都大于0.25um，故可用普通光学显微镜观察。１、普通光学显微镜(lightmicroscope)一、显微镜放大法微生物学医学知识讲座第2页电子显微镜分辨率为1nm。不但能看清细菌外形，内部超微结构可一览无余。２、电子显微镜(electronmicroscope)肺炎链球菌荚膜荚膜一、显微镜放大法微生物学医学知识讲座第3页3、透射电镜4、扫描电镜微生物学医学知识讲座第4页二、染色检验法因为细菌细胞微小又透明，普通先要经过染色才能作显微观察革兰氏染色法细菌染色判别染色法简单染色法负染色：正染色死菌活菌抗酸性染色法芽孢染色法姬姆萨染色法荚膜染色法用美蓝或TTC等作活菌染色微生物学医学知识讲座第5页（一）单染色法1、原理细菌体积小，五色半透明，在普通光学显微镜下不易观察清楚，通常需染色来增加菌体与背景之间色差，这比不染色标本清楚易辨。因为细菌等电点为pH2～5，在靠近中性环境中通常带负电荷，易与带正电荷碱性染料相结合而染上颜色，故惯用亚甲蓝、碱性复红、草酸铵结晶紫等染料染色。单染法只使用一个染料，所染细菌均被染成一个颜色，普通能够显示细菌形态、排列和大小，但不能显示细菌内部结构。微生物学医学知识讲座第6页２、惯用染料和器具

大肠杆菌和金黄色葡萄球菌18～24h培养物，生理盐水，亚甲蓝染色液，碱性复红染液，香柏油，二甲苯，显微镜，接种环，吸水纸，载玻片，酒精灯，擦镜纸。微生物学医学知识讲座第7页３、方法（1）涂片取洁净载玻片一块，滴一小滴生理盐水于载玻片中央(如被检材料是液体，可不加生理盐水)。将接种环在酒精灯火焰上灭菌，冷却后，伸人被检菌试管取菌少许(切不可多，更不可将培养基刮下)，混入载玻片上生理盐水中，磨匀并涂抹成直径1．5cm左右均匀薄层菌膜。将接种环灭菌后放回原处。（2）干燥涂片最好在室温中让其自然干燥。有时为了干燥得快些也可在酒精灯火焰上方烘干，但勿紧靠火焰；也能够用吹风机吹干。

微生物学医学知识讲座第8页３、方法（3）固定让菌膜面朝上，将载玻片在酒精灯火焰外层往返经过3次，此为“固定”。目标是使细胞质凝固，以固定细菌形态，并使细菌粘附于玻片上，染色和水冲时不会脱落。（4）染色将细菌涂片平置，滴加1滴亚甲蓝(或复红染液)于菌膜上，染液以覆盖涂抹标本为度，染色1—2min。（5）水洗斜置载玻片，用细水流从上端流下洗去多出染液。（6）干燥自然干燥或用吹风机吹干水分。（7）镜检先用低倍镜找到物像，并将物像调到视野中央，再于标本上滴上一滴香柏油，置于油镜下进行观察。

微生物学医学知识讲座第9页４、注意事项（1）固定时温度不可过高，以载玻片反面触及皮肤时热而不烫为宜。（2）水洗时，不要对着标本直接冲洗，以免冲去被检标本，普通以冲洗下来水基本无色为度。（3）染色完成，倾去水分，于室温中自然干燥，不可在标本上擦试，以免擦损标本。

微生物学医学知识讲座第10页微生物学医学知识讲座第11页（二）革兰染色法：

C.Gram（革兰）于1884年创造一个判别不一样类型细菌染色方法。二、染色检验法微生物学医学知识讲座第12页（二）革兰染色法１、染色步骤（1）初染（结晶紫30S）（2）媒染剂（碘液30S）（3）脱色（95%乙醇10~20S）（4）复染（蕃红30~60S）

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ABBBABAA（1）初染（结晶紫30S）革兰氏染色程序和结果（1）初染（结晶紫30S）（2）媒染剂（碘液30S）（3）脱色（95%乙醇10~20S）（4）复染（蕃红30~60S）微生物学医学知识讲座第14页ABBBABAA革兰氏染色程序和结果（2）媒染剂（碘液30S）（1）初染（结晶紫30S）（2）媒染剂（碘液30S）

（3）脱色（95%乙醇10~20S）（4）复染（蕃红30~60S）微生物学医学知识讲座第15页ABBBABAA革兰氏染色程序和结果（3）脱色（95%乙醇10~20S）（1）初染（结晶紫30S）（2）媒染剂（碘液30S）（3）脱色（95%乙醇10-20S）（4）复染（蕃红30~60S）微生物学医学知识讲座第16页ABBBABAA革兰氏染色程序和结果（4）复染（蕃红30~60S）A：革兰氏阳性细菌G+B：革兰氏阴性细菌G﹣为何？（1）初染（结晶紫30S）（2）媒染剂（碘液30S）（3）脱色（95%乙醇10~20S）（4）复染（蕃红30~60S）微生物学医学知识讲座第17页２、染色原理第一步：结晶紫使菌体着上紫色第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。第三步：酒精脱色，细胞壁成份和结构不一样，出现不一样反应。G+菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联涣散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后呈红色。微生物学医学知识讲座第18页３、结果判断菌体呈紫色为革兰氏阳性菌（G+）菌体呈红色为革兰氏阴性菌（G-）微生物学医学知识讲座第19页阳性菌阴性菌革兰阳性

革兰阴性微生物学医学知识讲座第20页４、注意事项

（1）载玻片要洁净无油。（2）涂片以匀薄为佳，切不可浓厚。过于密集菌体，因洗脱不匀常呈假阳性。（3）要严格控制各试剂作用时