色瑞替尼对精子制动作用和机制的初步研究

色瑞替尼对精子制动作用和机制的初步研究

精神障碍的调节已成为影响妊娠和不育以及安全防止生殖健康的重要课题。随着社会工业化程度的提高和环境污染的加重,不孕不育率显著增加。我国不孕不育率已高达15%~20%,其中与男性因素相关的约占50%。男性不育的主要原因是精子数量的减少和质量的下降。另一方面,如何安全避孕也是全球性的问题。目前,主要是女性负担了避孕的重任,而男性仅可采用性交中断(体外排精)、避孕套(阴茎套)和输精管绝育术。调查显示,男性可以也愿意承担更多的责任。不论男性还是女性,对男性避孕药的态度都相当积极我们在前期研究中发现翻译后修饰如乙酰化、磷酸化等对精子功能调控有重要作用,在此基础上针对性地从化合物库中筛选出一系列乙酰化、磷酸化相关的抑制剂且具有显著的调控精子功能活性的非激素类作为候选化合物。其中色瑞替尼(ceritinib)对人精子运动抑制效应非常明显,表现为20s内使所有精子失去运动活性所需的药物最小浓度(minmaleffectiveconcentration,MEC)比经典的杀精药物壬苯醇醚(nonoxynol-9,N-9)还要低3倍左右。色瑞替尼是治疗间变性淋巴瘤激酶-阳性转移且对克唑替尼进展或不能耐受的非小细胞肺癌患者的二线药物,2014年获美国FDA加速审批程序批准上市。FDA的研究报告了色瑞替尼导致孕鼠少量胚胎发育异常,但推荐剂量下用猴、大鼠进行的毒理学研究未发现其对雄性和雌性生殖器官有不良效应材料和方法主要试剂及仪器色瑞替尼(美国Selleck公司)溶解在DMSO(美国Sigma公司)中制备成10mmol/L储液;N-9(西安瑞联生物技术有限公司)溶解在超纯水中制备成40mg/mL储液;精子细胞BWW培养液(以下简称为BWW培养液)按WHO第5版配方配制,所需试剂均购自美国Sigma公司;LIVE/DEAD精子存活测定试剂盒(L-7011,美国Invitrogen公司);细胞增殖分析试剂盒(CCK-8,上海同仁药业股份有限公司);角质细胞无血清培养基(美国Gibco公司);计算机辅助精液分析(computerassistantspermanalysis,CASA,HTM-TOXIVOS版本12.3A)系统为瑞士汉密尔顿有限公司产品;扫描电子显微镜(Quanta250FEG,荷兰FEI公司);高级溅射镀膜仪(LeicaEMSCD050,上海电子光学技术研究所);透射电子显微镜CM120(荷兰Philips公司)。流式细胞仪(AccuriC6,美国BD公司);酶标仪(ELx800,美国BioTek公司);倒置相差显微镜(DMi1,德国Leica公司);激光共聚焦显微镜(A1R,日本Nikon公司)。细胞株及细胞培养基VK2/E6E7阴道上皮细胞系购自美国ATCC细胞库;End1/E6E7宫颈细胞系、Ect1/E6E7宫颈阴道细胞系均获赠于南京大学。所有细胞株均采用角质细胞培养基培养,37℃、5%CO实验动物SPF级C57小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,饲养至8~10周进行实验。精子制动实验精液标本的采集选取2016年3~9月就诊于上海计生所医院门诊部的男性患者,年龄25~35岁,平均年龄(30.0±5.0)岁,禁欲3~8天,手淫法收集精液,选取的精液样本应在0.5h内液化,精子密度≥15×10高活力精子的获取采用精子上游法获得高活力精子小鼠的高活力精子获取:将小鼠以颈椎脱臼法处死,取出小鼠附睾尾部并剪开一道小口,以镊子挤出里面的精液放入37℃预热的1mLBWW培养液中,在37℃、5%CO瞬间杀精效果测定瞬间杀精效果,即20s能够100%制动精子的最低药物浓度(minimaleffectiveconcentration,MEC)。实验共设空白对照组、阳性对照组(N-9)和色瑞替尼组。室温条件下在96孔板内用BWW培养液逐孔倍比稀释药物,每孔为50μL。96孔板放置在37℃、5%COCASA系统分析化合物制动精子的运动参数(10~20)×10精子复活试验选择经MEC色瑞替尼处理后的精子样本,以BWW培养液300×g离心5min,洗涤2次去除色瑞替尼,加入0.5mLBWW培养液,并在37℃、5%CO低渗膨胀实验300×g离心5min去除精子悬液中的药液,200μLBWW培养液重悬后取100μL加入1mL低渗膨胀(hypo-osmoticswelling,HOS)溶液(75mmol/L果糖,20mmol/L柠檬酸钠)混合,置于37℃温箱中30min。将混合液滴加在载玻片上,盖玻片封盖,倒置相差显微镜下计数显示特征尾部卷曲或肿胀的精子数目。精子尾部肿胀率=尾部肿胀数/精子计数的总数×100%。对照组中有60%以上的精子出现尾部肿胀,则认为HOS实验正常。流式细胞仪法检测精子存活率采用SYBR-14/PI双染法观察精子存活情况及质膜完整性。取5μLSYBR-14加入1mL精子悬浮液中(终浓度为100nmol/L),混匀后37℃、5%CO电子显微镜观察精子质膜的损伤取精子悬液制作涂片,晾干后在2.5%的戊二醛中固定2h,PBS300×g离心5min,洗3次,用1%锇酸固定,PBS300×g离心5min,洗3次,不同浓度酒精梯度脱水,离子溅射仪镀金后扫描电子显微镜观察并记录。300×g离心5min,沉淀精子,固定脱水,加包埋液浸透固化,切片,染色,透射电子显微镜下观察拍片。色瑞替尼对阴道上皮细胞的影响CCK-8测定药物对细胞的抑制作用收集对数生长期的VK2/E6E7、End1/E6E7、Ect1/E6E7细胞接种到96孔细胞培养板中,每孔接种约5000个细胞。待细胞贴壁后吸去培养液,PBS洗涤1次,将各培养孔分为对照组和药物处理组。在药物处理组中加入200μL预先配置好的各浓度梯度的色瑞替尼或N-9溶液,对照孔加入200μL培养液,分别培养24h、48h后去除培养液,加入不含血清的培养液100μL和10μL的CCK-8试剂。静置30min后,37℃继续培养2h,采用酶标仪测定450nm处吸光度(D)值,测得细胞抑制率,计算半抑制浓度(halfmaximalinhibitoryconcentration,IC药物对细胞形态的影响将VK2/E6E7、Ect1/E6E7和End1/E6E7细胞分别接种在细胞培养皿中,培养至贴壁细胞长至90%,更换培养液,分别用含和不含药物的角质培养基培养6h。用钙黄绿素-AM(Calcein-AM)、PI、Hoechst33342溶液分别进行细胞染色(终浓度分别为2μmol/L、4μmol/L和0.5μg/mL)。用激光共聚焦显微镜对活细胞和死细胞进行观察。统计学分析上述各实验分别重复3次,采用Graphpadprism7.0对数据进行统计分析,结果以x结果色瑞替尼对精子运动的抑制色瑞替尼20s内100%制动精子的MEC精子运动能力是精子最易观察的活性指标,在观察到色瑞替尼的体外精子运动抑制活性的基础上,我们参考Sander-Cramer方法色瑞替尼对精子的制动效果为了探究色瑞替尼对精子的制动作用是否有时间-浓度的依赖关系,我们利用CASA系统持续测定加药处理后精子的运动参数。色瑞替尼对人和小鼠精子运动的抑制作用表现为随着浓度增加和时间延长,精子活力(a+b+c级,a+b级)逐渐降低直至无活动精子(图2)。随着色瑞替尼浓度的升高,精子活力(a+b+c级,a+b级)降低的越快。当色瑞替尼浓度恒定时,随着给药时间的延长,活动精子数量逐渐下降(图2A、2A′)。可知色瑞替尼对人类及小鼠精子运动的抑制作用随着浓度增加而增强,且随着作用时间延长而增强,具有明显的剂量-时间依赖关系。由图2可见,30min处理使人和小鼠精子100%制动所需的色瑞替尼浓度分别为5和25μmol/L。而相同条件下,使人和小鼠精子100%制动所需的N-9浓度为200μmol/L,这表明色瑞替尼对精子的制动活性大于杀精剂N-9。色瑞替尼在2h内100%制动人精子的浓度低至5μmol/L。精子复活试验选取20sMEC色瑞替尼处理的100%精子制动的样本,洗去色瑞替尼并加入0.5mLBWW培养液,孵育30~60min,显微镜下未观察到活动精子,即色瑞替尼对精子的制动作用是不可逆的。HOS实验为了探究色瑞替尼抑制精子运动的机制,先以HOS实验来确定色瑞替尼作用于精子后精子的质膜是否完整。空白对照组中精子尾部84%发生肿胀蜷曲,证明精液标本及HOS低渗液正常。用N-9处理精子20s后HOS实验可见精子尾部几乎不发生肿胀(0.62%),提示膜已通透。色瑞替尼组的肿胀发生率低至4.67%(图3),提示色瑞替尼MEC在20s内能破坏精子质膜。流式细胞仪测定精子存活率绿色荧光标记质膜完整的活精子,红色荧光标记质膜遭破坏的死亡精子,发出两种荧光的双阳性精子为正处于濒死的过渡状态。空白对照组活精子比率达到84%(图4A),阳性对照N-9处理精子的死亡率达96.1%(图4B)。以50μmol/L色瑞替尼处理精子20s,精子膜通透,死亡率达93.9%(图4C),5μmol/L色瑞替尼处理精子30min的死亡率达96.2%(图4D)。表明色瑞替尼制动的精子质膜已经遭到破坏,并致细胞死亡。提示与N-9类似,色瑞替尼可能是通过破坏精子质膜而对精子产生制动效应。扫描及透射电子显微镜观察精子质膜改变扫描及透射电子显微镜观察空白对照组精子头部呈椭圆形,质膜表面光滑(图5A),质膜完整(图5C)。而用20sMEC的色瑞替尼处理精子头部与尾部结合处断裂较多,头部质膜有溶解性改变,尾部有起泡样改变(图5B);透射电镜下可见顶体轻微损伤,头颈部有断裂,头部质膜明显破裂,线粒体部分有明显损伤(图5D)。而N-9处理后精子质膜破坏严重,大部分精子顶体膜呈溶解性改变色瑞替尼对上皮细胞的影响色瑞替尼对上皮细胞具有细胞增殖抑制作用(图6)。色瑞替尼和N-9对VK2/E6E7细胞IC色瑞替尼和N-9分别处理VK2/E6E7细胞6h后,以钙绿黄素-AM/PI/Hoechst33342三重染色后放在激光共聚焦显微镜下观察,钙绿黄素-AM染活细胞发出绿色荧光,PI染死细胞发出红色荧光;Hoechst33342染细胞核发出蓝色荧光。空白对照组中VK2/E6E7绿色荧光较多,细胞形态完整,细胞生长良好;N-9处理后几乎没有绿色荧光,细胞大部分破裂死亡,细胞形态遭到破坏;色瑞替尼处理6h后,有的出现绿色荧光,但形态不完整(图7)。可见色瑞替尼对上皮细胞膜有一定的损伤。讨论我们首次报道色瑞替尼对精子的运动具有快速制动能力。色瑞替尼20s内100%制动人精子的MEC为(74.87±31.46)μmol/L,与经典杀精剂N-9的MEC[(219.75±20.89μmol/L)]比较,色瑞替尼具有更好的杀精制动效果。此外,色瑞替尼对人类和小鼠的精子均具有类似的精子制动作用,提示可能具有共同的作用机制。我们初步揭示了色瑞替尼体外制动精子运动活性的机制主要是通过破坏精子膜的完整性。N-9作用于精子的机