马立克氏病病毒的分离与初步鉴定

马立克氏病病毒的分离与初步鉴定

马丽斯病毒素（mdv）是马拉米星病毒素的成员，可能是鸡肿瘤。MD是一种可用疫苗预防的病毒性肿瘤病,自MDV首次分离以来1材料和方法1.1sdau132临床表现SDAU1501是在105日龄左右已免疫CVI988疫苗的白羽肉种鸡分离,临床表现为肝脏有肿瘤;SDAU1502是在110日龄左右已免疫CVI988疫苗的白羽肉种鸡分离,临床表现为心脏有肿瘤;SDAU1503是在120日龄左右已免疫814疫苗的白羽肉种鸡分离,临床表现为肝脏有肿瘤。1.2引物的设计与合成根据GenBank上的MDV参考强毒株及超强毒株序列,分别设计了扩增meq、pp38、vIL8基因的上、下游引物,引物委托上海生物工程有限公司合成。PCR产物测序委托北京华大基因完成。1.3细胞分离和细胞接种无菌采集病鸡抗凝血0.8mL,用淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞,接种120μL至长满单层次代鸡胚成纤维细胞(CEF)的6孔板中,37℃,5%CO1.4细胞病变后ba4单抗将感染病毒的CEF细胞接种于24孔板上,待出现细胞病变后,用PBS洗3遍后用丙酮乙醇(3∶2)固定8~10min,然后分别用BA4单抗1.5rtaq酶活动力学pcr从感染病毒的CEF细胞中提取病毒基因组作为模板,分别用1.2设计的引物扩增与病毒致病有关的基因meq、pp38和vIL8。50μLPCR反应体系:10×PCRBuffer5μL,dNTP4μL,上、下游引物各1μL,rTaq酶1μL,DNA模板1μL,最后加双蒸水至总体积50μL。PCR反应条件:95℃5min;95℃30s,55℃30s,72℃1min(31个循环);72℃再延伸10min,4℃保存。PCR反应结束后,用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR产物经胶回收后,送北京华大基因公司测序。测序结果用DNAS-tar软件和MEGA软件处理并与GenBank上其他MDV参考毒株的序列进行比较分析。2结果2.1鸡自愿性病:主要表现为外受精神不稳，出现红色囊包的情况,主要是受精3个鸡场的病鸡群初期发现有消瘦鸡只,精神沉郁,食欲减退,多数发病鸡出现神经症状,主要表现为步态不稳,共济失调;部分发病鸡在趾叉部位出现红色囊包,包内有积液,破溃后结痂。在发病高峰期时,几乎所有病鸡剖检可见肝脏、心脏出现绿豆粒大小的肿瘤,病理切片显示了大量淋巴细胞浸润(图1)。发病鸡几乎全部为母鸡,公鸡未见。2.2mdv蚀斑的检测分别将3个鸡场病鸡中分离的淋巴细胞分别接种原代CEF细胞,5d后未出现细胞病变,盲传至第3,4代出现典型MDV蚀斑,并分别命名为SDAU1501,SDAU1502和SDAU1503。然后,分别用抗MDV血清Ⅰ型特异性单克隆抗体BA4和鉴别MDV野毒株的单克隆抗体H19进行间接免疫荧光试验,在倒置荧光显微镜下可清晰地看到亮绿色的病毒蚀斑(图2),证明所分离的3株病毒为MDV血清Ⅰ型,且为野毒株。2.3相关致病基因检测为了更全面的了解3株病毒的特点,我们分别从感染的CEF细胞中扩增了MDV的相关致病基因meq、pp38和vIL8基因,电泳结果显示,meq基因长约1020bp,pp38基因长约820bp,vIL8基因长约650bp,均与预期目的片段大小相符(图3)。2.4同源性和氨基酸序列分析分别将3株MDV的meq、pp38和vIL8基因与标准参考毒株进行氨基酸序列比较分析,发现SDAU1503株与CVI988和814株在同一分支上,而SDAU1502和SDAU1501在另外同一分支上,与中国早期分离的GX0101距离较近(图4)。同源性分析发现SDAU1503meq基因与CVI988同源性最高为99.1%,而SDAU1502与SDAU1501同源性为100%,且与GX0101相同;pp38基因相对保守,SDAU1503和SDAU1502与GX0101序列完全一致,而SDAU1501与GX0101的同源性为99.7%,与其他国外参考毒株的同源性也高达99.3%;vIL8基因SDAU1503与4个国外标准毒株同源性最高为99.3%,而SDAU1502和SDAU1501与GX0101同源性最高,分别为98.5和99.3%,与国外参考毒株的同源性为97%。氨基酸序列分析发现3株MDV的meq基因在第71位氨基酸与其他标准强毒株均为A,而CVI988和814株在该点均为S;其次是SDAU1501和SDAU1502在第80,115,139和176位的氨基酸与GX0101具有相同的突变(D80Y,V115A,T139A,P176R),而SDAU1503在第194位有一个与CVI988相同的氨基酸缺失(P)(表2)。在pp38基因3种MDV毒株均出现了与GX0101一样的突变(表2);在vIL8基因SDAU1501和SDAU1502在第4,31位出现了与GX0101相同的变化(L4S,D31G),但SDAU1502在第93位出现了特有的氨基酸突变(E93V),其他参考毒株均无此类突变(表2)。3关meq在mdv细胞毒性检测中的作用近年来,MD在产蛋鸡群中的暴发在印度、日本均有报道pp38基因编码的是一个38000的磷蛋白,与病毒从潜伏期重新激活以及细胞的转化相关Meq是一个碱性亮氨酸拉链蛋白(bZIP),可与自身或cJun、JunB及Fos等形成二聚体,通过反式激活作用促进一些基因的表达,从而导致细胞发生转化vIL8