磁性微球为固相基质的药物-蛋白结合常数的测定

磁性微球为固相基质的药物-蛋白结合常数的测定

通常，药物会通过血浆储存和运输到达活性部位的药理。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白,药物与白蛋白之间的作用,影响药物在体内的分布、代谢与排泄,从而影响药物的作用强度和时间。因此,药物与白蛋白相互作用的研究无论对于新药研发还是指导临床合理用药都具有重要意义常用的研究药物与白蛋白相互作用的方法有平衡透析法、超滤法、紫外-可见吸收光谱法、荧光光谱法、圆二色谱法以及亲和色谱法和核磁共振法等近年来,磁性微球在生物化学和生物技术学方面的应用受到广泛关注。用修饰蛋白的磁性微球研究药物与蛋白的相互作用,通过测定游离的药物浓度,计算药物与蛋白的结合常数,这种方法高效、快速1实验部分1.1n-羟基德国回复突变/二醛质、酰氯-内酰胺nhs、吡啶、甘氨酸、考马斯亮蓝的研究牛血清白蛋白,分子生物学级,纯度98%;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC);N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、戊二醛(纯度50%)、吡啶、甘氨酸、考马斯亮蓝G250均为分析纯;布洛芬、色氨酸、罗氟司特、安立生坦、瑞替加滨均为医药级;表面氨基化的四氧化三铁磁性微球(Fe岛津高效液相色谱仪(包括LC-600恒流泵,SPD-6AV紫外检测器和N2000色谱工作站);岛津UV-2450紫外-可见分光光度计;C1.2bsa覆盖磁性微球的制备分别采用EDC/NHS和戊二醛作为偶联剂,将BSA偶联至氨基修饰的磁性微球上。1.2.1edc/nhs法100mg磁性微球分散于2mL磷酸盐缓冲液(PBS缓冲盐,10mmol/L,pH7.4)中,加入50mgEDC,25mgNHS和适量BSA,室温振荡反应2h。磁分离,保留上清,磁性微球用PBS洗涤3次。1.2.2磁性微球的制备100mg磁性微球用吡啶缓冲液(10mmol/L,pH5.5)洗涤后,分散于2mL含5%戊二醛的吡啶缓冲液中,37℃反应5h。用吡啶缓冲液洗涤磁性微球3次;再将磁性微球分散于2mL吡啶缓冲液中,加入适量BSA,37℃反应16h。磁分离,收集上清,磁性微球加入1mL甘氨酸终止液(1mol/L,pH8.0),于37℃反应1h,用PBS溶液洗涤3次。1.3b洛芬与b-bsa的相互作用1.3.1布洛芬的高效液相色谱法在1.5mL的离心管中,加入200μLMB-BSA(50mg/mL)和200μL布洛芬(10μmol/L),37℃振荡反应不同时间,磁分离,上清用高效液相色谱(HPLC)检测布洛芬的浓度。1.3.2布洛芬含量测定布洛芬与MB-BSA作用后,收集上清,用HPLC检测布洛芬的含量;用洗脱液将布洛芬洗脱后,将MB-BSA再次与布洛芬作用,如此重复6次。1.3.3布洛芬浓度的检测将布洛芬用PBS缓冲盐溶解并稀释至不同浓度(1.0~40.0μmol/L)。在1.5mL的离心管中加入200μLMB-BSA(50mg/mL)和200μL一系列不同浓度的布洛芬,37℃振荡反应,磁分离,上清用高效液相色谱(HPLC)检测布洛芬的浓度,通过罗森塔尔方程1.4药物与b-bsa的结合步骤同1.5.2节,测定色氨酸、安立生坦、瑞替加滨和罗氟司特4种药物与BSA的结合常数。1.5分析1.5.1蛋白键合量的测定采用Bradford蛋白定量法,通过考马斯亮蓝G250与蛋白的显色反应,测定键合前后上清液中的蛋白含量的变化,计算磁性微球上BSA的键合量。1.5.2布洛芬的含量是由此数据测定的HPLC检测条件C1.5.3四种药物的含量是由降低的1.5.3.1-氨酸1.5.3.2.安全1.5.3.3.瑞利加斌1.5.3.4-rofos2结果与讨论2.1是否应当保证尽量低的非特异性吸附?药物与BSA结合的同时,也会在载体磁性微球上产生非特异性吸附。磁性微球对药物的非特异性吸附越高,药物与BSA之间的特异性吸附越不明显,实验误差就越大。因此,应当保证尽量低的非特异性吸附。对几种常用的商品化的磁性微球———UF-MB、PS-MB和Fe由图1可知,UF-MB和PS-MB对布洛芬和色氨酸的非特异性吸附较低,而对瑞替加滨的非特异性吸附较明显;Fe2.2微球上的氨基EDC与NHS联合使用,与蛋白上的羧基反应,形成活性中间体,该活性中间体与磁性微球上的氨基脱水形成酰胺键。戊二醛则是通过分子两端的醛基分别与蛋白和磁性微球上的氨基形成亚胺,从而将蛋白固定于微球上,结果见图2。由图2可知,当BSA加入量较少时,蛋白键合量较低,但体系中BSA几乎完全与磁球偶联,蛋白利用率接近100%;随着BSA用量的增加,蛋白键合量随之增加,而蛋白利用率也随之降低;当BSA与磁性微球的质量比达到100μg/mg左右时,键合量达到饱和,不再增加。EDC法的蛋白最大键合量为44μg/mg,蛋白利用率为44%;戊二醛法的最大键合量为49μg/mg,蛋白利用率为49%。两种方法均比报道显著提高2.3iiia、iiia、iiia、iiia、iiia、iiia、iiia、iiia、iiia、iiia、iiia、iiia药物分子的关系BSA的晶体结构有3个类似的结构域:I、II、III,每个结构域有2个亚域结构A和B,这些亚域结构被命名为IA、IB、IIA、IIB、IIIA和IIIB,而药物分子主要结合在亚域结构IIA和IIIA,其中,IIIA中的结合空腔最活跃,布洛芬、色氨酸等药物是在结构域IIIA结合的典型药物2.3.1mb-bsa对布洛芬的吸附时间对结合量的影响布洛芬与空白磁性微球和BSA包覆的磁性微球作用前后的上清液色谱图,结果见图3。由图3可知,BSA包覆的磁性微球对布洛芬具有明显的吸附作用,而空白磁性微球对布洛芬几乎没有吸附作用。以布洛芬为模型药物,考察了MB-BSA与药物的作用时间对结合量的影响,结果见图4。由图4可知,布洛芬在20min之前与MB-BSA迅速作用,并在20min达到吸附平衡。因此,固定MB-BSA与药物的作用时间为20min。2.3.2洗脱溶剂对mb-bsa的吸附以布洛芬为模型药物,研究药物与BSA的相互作用模式,结果见图5。由图5可知,不洗脱时,随着重复使用次数的增加,MB-BSA对布洛芬的结合量逐渐降低,在第4次利用时,吸附量几乎为零,说明此时MB-BSA对布洛芬的吸附达到了饱和。用纯甲醇洗脱后,MB-BSA对布洛芬的吸附量几乎没有变化;用缓冲盐洗脱后,MB-BSA对布洛芬的相对吸附量约为80%。这说明BSA与布洛芬之间存在疏水作用力和静电作用力,其中疏水作用力占主导。当用甲醇作为洗脱剂时,甲醇破坏了BSA与布洛芬之间的疏水作用力,布洛芬从BSA上完全解吸附;缓冲盐破坏了BSA与布洛芬之间的静电作用,而疏水作用力仍存在,因此,布洛芬从BSA上部分解吸附。另一方面,用甲醇作为洗脱剂并不影响MB-BSA的重复利用,与文献中有机溶剂会影响BSA活性的报道2.3.3布洛芬与bsa的结合常数药物与蛋白的作用是一个动态过程,用S代表蛋白上的位点,D代表药物小分子,D当药物与蛋白的作用达到平衡时,药物与蛋白的结合常数K假设蛋白上所有活性位点的浓度为B[D图6和图7分别为布洛芬在MB-BSA上的饱和吸附曲线及罗森塔尔曲线。可以计算布洛芬的K2.4药物对罗森塔尔曲线的影响各药物在MB-BSA上的饱和吸附曲线图,结果见图6。由图6可知,随着药物浓度的增加,吸附量随之增加并趋于饱和。不同药物的罗森塔尔曲线图,结果见图7。由图7可知,色氨酸及3类新药安立生坦、瑞替加滨、罗氟司特与BSA的结合常数与布洛芬的结合常数均在一个数量级上。3流动相5/40m建立了一种用B