离子交换柱层析法分离氨基酸

离子交换柱层析法分离氨基酸离子交换柱层析法分离氨基酸第1页目标要求（1）学习采取离子交换树脂分离氨基酸基础原理。（2）掌握离子交换柱层析法基础操作技术。离子交换柱层析法分离氨基酸第2页一、原理

离子交换层析是用离子交换剂（含有离子交换性能物质）作固定相，利用它与流动相中离子能进行可逆交换性质来分离离子型化合物层析方法。Ø

即溶液中离子同离子交换剂上功效基团交换反应过程。离子交换柱层析法分离氨基酸第3页离子交换柱层析法分离氨基酸第4页离子交换柱层析法分离氨基酸第5页

带电荷量少，亲和力小先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大后被洗脱下来。离子交换柱层析法分离氨基酸第6页离子交换过程示意：起始吸附解吸完成

x+:起始缓冲离子

y+：待分离离子

z+：待分离离子

离子交换柱层析法分离氨基酸第7页二、离子交换剂种类

在惰性载体上引入带有电荷活性基团即离子交换剂。（一）按活性功效基团带电荷性质不一样阳离子交换剂—

带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂

—

带正电荷，与阴离子交换离子交换柱层析法分离氨基酸第8页（二）按载体种类不一样1.离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂苯乙烯+二乙烯苯

聚苯乙烯（单体）（交联剂）二乙烯苯交联度

=————————×100%

苯乙烯+二乙烯苯离子交换柱层析法分离氨基酸第9页交联度大，网孔变小，大分子量离子不能进入树脂颗粒内发生离子交换。在不影响分离情况下，以采取交联度较高树脂为好，这么能够提升树脂对离子选择性。离子交换柱层析法分离氨基酸第10页目数：离子交换树脂颗粒直径大小Dowex50为20-50目Dowex20840

m50297

m100149

m

（代表二乙烯苯百分含量）离子交换柱层析法分离氨基酸第11页树脂resin（据所含交换基团性质分）阳离子交换树脂

强酸型含磺酸基团(R-SO3H)

中等酸型含磷酸基团(-O-PO2H4)

弱酸型含酚基、羧基阴离子交换树脂

强碱含季胺基团[-N+(CH3)3]

弱碱含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2

阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。

离子交换柱层析法分离氨基酸第12页2.离子交换纤维素阴离子交换纤维素—如:DEAE-纤维素pH8.6以下分离中性或酸性物质,具二乙胺乙基阳离子交换纤维素—如:CM-纤维素普通pH>4条件下使用,含有羧甲基离子交换柱层析法分离氨基酸第13页3.离子交换凝胶—

分离大分子物质如：葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺（PAG）、琼脂糖（Sepharose）离子交换柱层析法分离氨基酸第14页三、操作注意点

（一）离子交换剂选择标准：依据被分离物质性质选择—同一性质离子交换剂中选取对被分离物质各组分之间结协力差异大型号交换剂，以确保经过离子交换层析后能得到比较满意结果。离子交换柱层析法分离氨基酸第15页考虑原因：1.被分离物质带何种电荷2.被分离物质分子大小大分子物质选取凝胶，其次选取纤维素3.被分离物质所处环境4.被分离物质物理化学性质5.被分离物质大约数量离子交换柱层析法分离氨基酸第16页依据分离过程试验条件强酸强碱—应用广泛弱酸型—只能在碱性pH范围内使用弱碱型—只能在酸性pH范围内使用离子交换柱层析法分离氨基酸第17页（二）缓冲液选择标准：不能发生化学反应，所带电荷应与样品一致。防止使样品变性离子交换柱层析法分离氨基酸第18页(三)洗脱剂

标准：所用洗脱液比吸着物质含有更活泼离子或基团改变pH或离子强度

增强洗脱液与离子交换剂结协力

降低分离物与离子交换剂结协力洗脱方式：梯度洗脱离子交换柱层析法分离氨基酸第19页四、应用

分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其它带电生物分子离子交换柱层析法分离氨基酸第20页离子交换层析法分离氨基酸及测定

离子交换柱层析法分离氨基酸第21页[原理]

所用样品为天冬氨酸和赖氨酸混合液，分别属酸性氨基酸(pI2.77)、碱性氨基酸(pI9.74)，在缓冲溶液中分别带正电荷和负电荷，与强酸型阳离子交换树脂Dowex50亲和力有很大不一样，在一定洗脱条件下洗脱，将它们分离。利用氨基酸可与茚三酮反应生成有色化合物进行氨基酸判定。离子交换柱层析法分离氨基酸第22页紫色物质，用于α－氨基酸比色测定和纸层析显色与水含茚三酮反应：离子交换柱层析法分离氨基酸第23页

AspLyspH4.2pH>10离子交换柱层析法分离氨基酸第24页[器材]

1.

层析柱等2.

沸水浴离子交换柱层析法分离氨基酸第25页[试剂]

Dowex502mol/LNaOHpH5.3柠檬酸缓冲液样品液：氨基酸混合液茚三酮混合液离子交换柱层析法分离氨基酸第26页试验步骤1．树脂处理将干强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。用4倍体积2mol/L盐酸浸泡1小时，倾去清液，洗至中性。再用2mol/L氢氧化钠处理，做法同上。最终用欲使用缓冲液浸泡。2．装柱取直径1cm,长度10－12cm层析柱。将柱垂直至于铁架上。自顶部注入上述经处理树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量溶液，再加入一些树脂，至树脂沉降至8~10cm高度即可。装柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整。液面不低于树脂。离子交换柱层析法分离氨基酸第27页3．平衡将缓冲液瓶与恒流泵相连，恒流泵出口与层析柱入口相连，树脂表面保留3－4cm液层，开动衡流泵，以24ml/h流速平衡，直至流出液pH与洗脱液相同。

4.加样揭去层析柱上口盖子，待柱内液面至树脂表面1－2mm关闭出口，沿管壁四面小心加入0.5ml样品，慢慢打开出口，同时开始搜集流出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，即刻加入少许柠檬酸缓冲液冲洗加样品处数次，然后注入柠檬酸缓冲液至液面高3－4cm左右，接恒流泵。

5.洗脱以缓冲液洗脱，开始用试管搜集洗脱液，每管搜集1mL，共搜集60—80管。离子交换柱层析法分离氨基酸第28页6．洗脱及氨基酸判定

向各管搜集液中加1mL水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中准确加热5min后冷却至室温，再加入3mL0.1%硫酸铜溶液。混匀，以搜集液第2管为空白，测定A570波长光吸收值，以光吸收值为纵坐标，以洗脱液体积为横坐标绘制洗脱曲线。离子交换柱层析法分离氨基酸第29页试验结果依据氨基酸解离性质，分析该试验条件下氨基酸从层析柱洗脱下来次序。离子交换柱层析法分离氨基酸第30页Separationofaminoacidsonacati