长链非编码rnacs-s对伪狂犬病毒复制的影响

长链非编码rnacs-s对伪狂犬病毒复制的影响

猪伪病毒素（prv）是导致猪伪病毒素（pd）引起的疾病，导致仔猪死亡。公猪的体液质量下降，失去了使用寿命。她怀孕了祖母，生下了一名教师。这给养猪业带来了严重的经济损失。长链非编码RNA(longnoncodingRNAs,lncRNAs)是不具有编码蛋白质能力、大于200nt的转录本但是PRV编码的lncRNA作用机制尚未报道。Tombácz等在感染PRVKaplan株的PK-15细胞中鉴定出2种lncRNA，分别为CTO-L与CTO-S1材料和方法1.1cna3.1和prvea-bac感受态猪肾上皮细胞PK-15、牛肾上皮细胞MDBK购自中国典型培养物保藏中心(武汉)；pEPKan-S2、pcDNA3.1(+)由本实验室保存；pMDEscherichiacoliGS1783PRVEa-BAC感受态由本实验室构建并保存伪狂犬病毒鄂A株(PRVEa)由本实验室分离并保存。1998年，陈焕春等从湖北省某些猪场大批死亡的新生仔猪的脑及内脏中分离到伪狂犬病病毒，并将该毒株命名为猪伪狂病病毒鄂A株1.2引用设计根据GenBank(KX423960.1)公布的PRV基因组序列，用Primer5软件设计引物(表1)。1.3全race分析与sis1.3.1总rna提取及合成PRVEa感染PK-15细胞24h后Trizol法提取总RNA，以总RNA为模板逆转录合成cDNA，逆转录引物末端连接oligo(dT)1.3.25.race参考Liu等的Capping-RACE方法1.4pcd3.1-co-s将CTO-S基因全长克隆下来，CTO-S基因的3ʹ末端加上His标签，通过EcoRI/KpnI双酶切以及酶连的方法将CTO-S基因插入到真核表达质粒pcDNA3.1中构建pcDNA3.1-CTO-S。将质粒转染至PK-15细胞，24h后收取蛋白样品进行Westernblotting检测。1.5缺乏植物和回复突变植物的构建参考Zheng等的研究方法1.6步法繁殖曲线和多步法繁殖曲线参考Yan等的研究方法，测定病毒的一步法增殖曲线以及多步法增殖曲线1.7pk-15细胞的6孔板将病毒以120PFU/孔接种于长满单层PK-15细胞的6孔板中。2h后每孔覆盖约1mL含4%羧甲基纤维素钠和2%FBS的DMEM培养基，置于37°C、5%CO1.8小鼠磁珠凝胶电泳设计引物克隆CTO-S全长，并且在5′端连接T7启动子序列，根据罗氏生物素标记体外转录试剂盒说明书操作，合成生物素标记的RNACTO-S以及生物素标记的反义RNA(作为阴性对照)。将生物素标记的RNA与细胞裂解产物以及链霉素亲和磁珠室温孵育。蛋白-RNA-磁珠复合物低速离心，小心移除上清，RIP缓冲液清洗磁珠5遍，小心吸取上清加入5×SDS缓冲液，95°C加热10min，对样品进行SDS凝胶电泳并用考马斯亮蓝染色。同时将样品送公司进行质谱分析。1.9prveawt细胞毒性检测构建真核表达质粒pcDNA3.1-RNAbindingprotein和pcDNA3.1-cytochromeb-c1并且添加HA标签，分别转染至PK-15细胞中，在转染16h后以5MOI接种病毒PRVEaWT，接毒12h后收取细胞裂解液，并取其中一部分作为阳性对照Input组；另一部分上清中加入抗体Anti-HAtag4°C孵育过夜；阴性对照组孵育抗体IgG。再加入20μL充分重悬的proteinA+Gagarose,4°C孵育数小时；1000×g离心5min，小心移除上清，预冷的PBS洗涤沉淀5次，小心吸取上清，Trizol法提取RNA,DNaseⅠ消化后进行RT-PCR检测CTO-S。1.10prvco-s和回复突变株对大鼠乘子感染的检测准备1块96孔细胞培养板，接种PK-15细胞培养12h。待细胞融合度达到80%，将细胞分为4组，5个孔加入PK-15细胞裂解液作为对照(mock组)；5个孔以5MOI感染PRVEaWT(野毒组)；5个孔以5MOI感染PRVΔCTO-S(突变株组)；5个孔以5MOI感染PRVΔCTO-SR(回复突变株组)。病毒感染48h后，每孔加20μL的MTT(5mg/mL)，孵育4h，终止培养。吸弃培养基，每孔加入DMSO200μL,37°C孵育30min，至颗粒完全溶解。以对照孔(培养基、MTT、DMSO、无细胞)调零，酶标仪测定490nm的吸光度OD值。GraphPadprism7软件统计数据，并对测量数据进行t-检验对分析，P>0.05的统计值被认为没有显著差异，P<0.05的统计值被认为差异显著，P<0.01的统计值被认为差异极其显著。2结果与分析2.1to-s的结构利用3′RACE和5′RACE对CTO-S末端进行PCR扩增，扩增片段的测序结果显示，CTO-S具有多聚腺苷酸(polyA)尾巴以及帽子(cap)结构，全长为267bp，位于UL22基因和UL21基因之间，3′端与UL22基因3′端相距856bp,5′端与UL21基因3ʹ端相距743bp，与复制起始位点oriL相邻，与其相距79bp(图1)。2.2功能2编码多肽能力和编码多肽能力为了研究CTO-S基因编码蛋白或多肽的能力，首先扩增CTO-S基因全长，在3′端分别加上6×His标签、T+6×His标签和TT+6×His标签3种不同阅读框模式，将目的片段克隆到pcDNA3.1中(图2A),Westernblotting结果显示CTO-S目的基因蛋白3种阅读框模式都没有检测到相应蛋白(图2B)，说明CTO-S不具有编码多肽的能力。2.3缺乏植物和回复突变植物的构建2.4样中co-s对prv复制的影响在10MOI接毒剂量下，PRVEaWT、rPRVEaΔCTO-S和rPRVEaΔCTO-SR在每个时间点的毒滴度均没有明显差异(图4A)，表明在高剂量接毒情况下，CTO-S对PRV的复制没有明显的影响。在0.01MOI接毒剂量下，CTO-S缺失株与野毒株以及回复突变株相比，胞内以及胞外病毒滴度均没有显著差异(图4B)，表明CTO-S对PRV在PK-15细胞中的组装和释放均无影响。野毒株的空斑直径平均为0.650mm，缺失株空斑直径为0.649mm，回复突变株空斑直径为0.651mm(图4C)。缺失重组毒与野毒株相比统计学分析没有显著性差异(图4D)，说明CTO-S缺失株在上皮细胞的横向扩散能力不受影响。2.5ct-s和cytochromeb-c1cmpes1相互连接2.6突变株与野生株活细胞数量的比较将细胞分为mock、野毒株、突变株、回复突变株4组，分别接种细胞裂解液(对照)或感染不同的病毒毒株，48h后MTT法检测细胞活性，490nm的吸光度OD值越大，则活细胞数量越多。结果如图7所示：与mock组相比，野毒株、突变株、回复突变株组的活细胞数量均减少，与野毒株组以及回复突变株组相比，突变株组的活细胞数量更多，并且具有显著性差异。CTO-S缺失后，细胞凋亡减少，说明CTO-S能够诱导细胞凋亡。3重组质粒的构建随着测序技术的发展，长链非编码RNA的功能研究成为热点。了解CTO-S的真实全长序列能够为其功能研究奠定基础。我们首先利用3′RACE和5′RACE鉴定PRVEaWT株中CTO-S的末端序列，CTO-S全长为267bp，该研究结果为首次报道。研究发现部分lncRNA可以编码多肽为了研究CTO-S的功能，利用细菌人工染色体(BAC)技术以及同源重组的方法成功构建出CTO-S缺失株以及回复突变株。一步法增殖曲线、多步法增值曲线以及空斑大小的结果均表明CTO-S对于PRV的复制是非必需的。人类巨细胞病毒表达的5kb的内含子lncRNA被证明不影响病毒在成纤维细胞中的复制为了进一步研究CTO-S的功能，利用RNApulldown联合质谱的方法筛选与CTO-S互作的宿主蛋白，选择总肽段覆盖率高的2个蛋白(cytochromeb-c1complexsubunit1,mitochondrial和RNAbindingprotein)进行RNA免疫共沉淀验证，结果表明这2个蛋白能够与CTO-S互作。但是RNAbindingprotein与RNA的相互结合不具有特异性，而cytochromeb-c1complexsubunit1是泛醇细胞色素C还原酶复合物(ubiquinol-cytochromeCreductase)的组分部分，因此又称ubiquinol-cytochromeCreductasecoreprotein1(UQCRC1)，其是线粒体呼吸链的一部分，在呼吸作用ATP的产生过程中发挥重要作用。根据研究报道，cytochromeb-c1complexsubunit1还抑制细胞的凋亡。UQCRC1的敲低降低线粒体膜电位，诱导永生化小鼠精母细胞凋亡Red重组构建的CTO-S缺失株以及回复突变株提取病毒基因组并进行PCR扩增，扩增片段送公司测序，利用Megalign软件将测序结果与PRVEaWT基因组序列进行比对。结果显示缺失株CTO-S序列成功缺失(图3A)，得到的病毒命名为rPRVEaΔCTO-S；回复突变株CTO-S序列成功回复(图3B)，命名为rPRVEaΔCTO-SR。CTO-Spulldown筛选CTO-S的互作蛋白进行凝胶电泳(图5A泳道2),CTO-S反义链pulldown的蛋白作为阴性对照(图5A泳道1)。质谱分析结果显示，实验组筛选到907个蛋白，对照组存在813个蛋白，实验组和对照组重合675个蛋白(图5B)。其中cytochromeb-c1complexsubunit1与RNA-bindingprotein总肽段覆盖率高，利用RIP技术进行进一步的验证。首先构建pcDNA3.1-cytochromeb-c1compl