第二章各种工具酶课件

第二章各种工具酶第二章各种工具酶1内容提要第一节限制性核酸内切酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶(聚合酶I/Taq聚合酶/反转录酶)内容提要第一节限制性核酸内切酶2第一节限制性核酸内切酶

Restrictionendonuclease（RE）一、限制性核酸内切酶的概念二、限制性内切酶的命名三、限制性内切酶的类型四、影响限制性酶活性的因素五、限制性内切酶对DNA的消化第一节限制性核酸内切酶Restrictionendo3一、概念1.定义是一类能够识别双链DNA中的特定核苷酸序列，并在特定位点切割双链DNA的内切酶。2.来源细菌的限制性内切酶。一、概念1.定义43.功能(1)限制Restriction侵入细菌体内的外源DNA（非甲基化），能被限制性内切酶识别和降解，从而保护自身的DNA不被降解。3.功能(1)限制Restriction5图细菌的限制系统图细菌的限制系统6细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，从而防止限制性内切酶的识别和水解。①Dam甲基化酶在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基。②Dcm甲基化酶在CCAGG序列的第2个胞嘧啶C5位引入甲基。(2)修饰Modification细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，从而防止限制性内切酶的识别7图细菌的修饰系统图细菌的修饰系统8图甲基化位点：DNA上的A/C图甲基化位点：DNA上的A/C9二、限制性内切酶的命名1973年Smith等提出酶的命名原则。用属名的第一个字母和种名的头两个字母，表示宿主菌的物种名。如大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示。用一个大写字母表示菌株或型。如EcoR。同一宿主菌内，如有不同的限制酶，用罗马字母表示。如EcoRI。二、限制性内切酶的命名1973年Smith等提出酶的命名原则10限制酶的命名限制酶的命名11图几种重要的限制酶图几种重要的限制酶12图几种限制酶的识别位点图几种限制酶的识别位点13三、限制性内切酶的分类分为I型、II型和III型。三、限制性内切酶的分类分为I型、II型和III型。141.I型限制性内切酶1968年，首先由M.Meselson和R.Yuan在大肠杆菌B株和K株分离。如EcoB和EcoK。（1）识别序列未甲基化修饰的特异序列：EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.I型限制性内切酶1968年，首先由M.Mesel15（2）切割位点切点距离识别位点约400~7000bp。不在识别位点。随机切开一条单链。如一条DNA链甲基化，就行使甲基化酶功能，使另一条链甲基化。如两条链已甲基化，酶从DNA链解离。需ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸。（2）切割位点切点距离识别位点约400~7000bp。不在162.III型限制性内切酶与I型酶有甲基化功能。能在DNA链上的特异位点切割。其切割位点在识别位点以外。反应需要ATP、Mg2+和S-腺苷蛋氨酸。基因工程中用途不大。如EcoP15:CAGCAG------

2.III型限制性内切酶与I型酶有甲基化功能。173.II型限制性内切酶1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox首先从流感嗜血菌中分离出HindⅡ。（1）识别序列与特点双链DNA。未甲基化修饰的靶序列。识别序列长度4~8bp。多数是回文结构。IIs型除外。（2）酶切位点在识别位点处，切开双链DNA，形成粘性末端或平齐末端。3.II型限制性内切酶1970年，H.O.Smith和K18图Ⅱ类酶识别序列特点：回文序列图Ⅱ类酶识别序列特点：回文序列19(3)平齐末端bluntendEcoRV：产生平齐末端。5’-GAT

ATC-3’3’-CTA

TAG-5’(3)平齐末端bluntendEcoRV：产生平20(4)粘性末端stickyend含有几个核苷酸的单链末端。①5´端突出EcoRI：形成5’-粘性末端。5’-G

AATTC-3’3’-CTTAA

G-5’②3´端突出PstI：形成3’-粘性末端。5’-CTGCA

G-3’3’-G

ACGTC-5’(4)粘性末端stickyend含有几个核苷酸的单链21G

AATTC

CTTAA

G

GAATTC

CTTAA

G5’--3’

3’--5’

5’--3’

3’--5’

EcoRI：5’端凸出GAATTCCTTAAGG22CTGCA

G

G

ACGTC

5’--3’

3’--5’

5’--3’

3’--5’

CTGCAG

GACGTC

PstI：3’端凸出CTGCAGGACGTC5’--3’3’--5’23③粘性末端的意义连接方便不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。③粘性末端的意义连接方便24图粘性末端连接图粘性末端连接255’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。补平成平齐末端粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。5’末端标记26四、同裂酶Isoschizomers识别位点的序列相同的限制性内切酶。①完全同裂酶识别序列相同和切点相同。

HindⅢ5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’

HsuI5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’

四、同裂酶Isoschizomers识别位点的序列相同的27XmaI5’-C

CCGGG-3’3’-GGGCC

C-5’SmaI5’-CCC

GGG-3’3’-GGG

CCC-5’②不完全同裂酶识别序列相同，但切点不同。XmaI5’-CCCGGG-3’②不完全28五、同尾酶Isocaudamers1.定义识别序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI等为同尾酶。2.特点同尾酶的粘性末端互相结合后，形成的新位点，不能再被原来的酶所识别。五、同尾酶Isocaudamers1.定义295’-G

GATCC-3’3’-CCTAG

G-5’

BamHIBclI5’-T

GATCA-3’3’-ACTAG

T-5’5’-A

GATCT-3’3’-TCTAG

A-5’

BglⅡ5’-GGATCC-3’BamHIBclI5’-T305’-G

3’-CCTAG

GATCT-3’

A-5’

BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’

BamHIBglⅡSau3A同尾酶的粘性末端结合形成的新位点不能再被原来的酶识别5’-GGATCT-3’BamHIBglⅡ5’-GG31六、限制酶的活性限制性内切酶的识别和酶切活性，只有在最适条件下，才表现出最大酶切能力和位点专一性。1.活性的定义在适当反应条件下，1小时内完全酶解1

g特定DNA底物，所需要的限制性内切酶的量，为一个活性单位。六、限制酶的活性限制性内切酶的识别和酶切活性，只有在最适条件32星号活性:改变反应条件，导致限制酶的专一性和切割效率的改变。如EcoRI和BamHI等都有*活性。使用时要防止星号活性。2.星号活性（*）星号活性:2.星号活性（*）33在低盐、高pH（>8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等5’-GAATTC-3’EcoRI：在低盐、高pH（>8）时可识别和切割GAATTA、AAATT34七、三类限制酶的特性比较特性I类内切酶II类内切酶III类内切酶限制和修饰作用的活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶酶蛋白结构3种不同亚基同型二聚体2种不同亚基限制所需要的辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+

ATP、Mg2+和SAM特异性位点或识别序列EcoB：TGA(N)8TGCT回文序列EcoRI：GAATTCEcoP1:AGACC七、三类限制酶的特性比较特性I类内切酶II类内切酶III类内35八、影响限制性酶活性的因素1.DNA的纯度DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。采取措施：①纯化DNA②加大酶的用量③延长保温时间④扩大反应体积（>20

l）八、影响限制性酶活性的因素1.DNA的纯度362.DNA的甲基化程度（1）大肠杆菌有2种甲基化酶修饰质粒：dam甲基化酶：修饰GATC中的A。dcm甲基化酶：修饰CCA/TGG的C。（2）基因工程中使用的是甲基化酶失活突变的菌株。2.DNA的甲基化程度（1）大肠杆菌有2种甲基化酶修饰质粒373.温度Tm不同的限制性内切酶，最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。酶最适oC酶最适oC酶最适oCMaeIIMaeIII5055BstEIITaqI6065ApaIMaeISmaI3045253.温度Tm不同的限制性内切酶，最适反应温度不同。酶最384.缓冲液Buffer缓冲液是影响限制酶活性的重要因素。化学组成：MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度。Tris-HCl：维持pH。二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性。牛血清白蛋白（BSA）：有助于酶的稳定。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。4.缓冲液Buffer缓冲液是影响限制酶活性的重要因素39九、限制性内切酶酶切图谱Restrictionmapping1.限制酶对DNA的酶切方法完全酶切/消化对DNA上所有的识别位点都被酶切开。应用有限。部分酶切/消化DNA上只有部分酶切位点被切开。部分酶切的方法：缩短保温时间、降低反应温度、减少酶的用量。九、限制性内切酶酶切图谱Restrictionmappin40图完全酶切如EcoRI（GAATTC）的4个位点都被切开。12341234图完全酶切如EcoRI（GAATTC）的4个位点都被41图部分酶切4个EcoRI位点中，仅酶切2个位点。123414图部分酶切4个EcoRI位点中，仅酶切2个位点。123422.限制性内切酶图谱（1）定义DNA上某些限制性内切酶酶切位点的图谱，可作为DNA片段的特殊标记。也称DNA物理图谱。2.限制性内切酶图谱（1）定义43（2）酶切图谱的建立识别4个核苷酸的内切酶，在DNA链上出现机率为：1/44＝1/256bp识别6个核苷酸的内切酶，在DNA链上出现机率为：1/46＝1/4.1kb识别8个核苷酸的内切酶，在DNA链上出现机率为：1/48＝1/65.5kb（2）酶切图谱的建立识别4个核苷酸的内切酶，在DNA链上出现443.限制酶酶切图谱的分析EcoR1NotIEcoRINotI2.0kb3.0kb1.0kbEcoRINotIEcoRI/NotI3.0kb5.0kb2.0kb3.0kb5.0kb4.0kb1.0kb3.限制酶酶切图谱的分析EcoR1NotIEcoRINot454.酶切产物的检测琼脂糖凝胶电泳法DNA经内切酶酶切，然后在琼脂糖凝胶电泳分析。适合小分子DNA分析。SouthernBlot法DNA酶切后，电泳分离。后变性后转移到尼龙膜或硝酸纤维膜，然后与同位素标记的探针杂交，最后做放射自显影，检测多态性条带。4.酶切产物的检测琼脂糖凝胶电泳法46琼脂糖凝胶电泳图谱琼脂糖凝胶电泳图谱47第二节DNA连接酶ligase内容提要一、DNA连接酶的种类二、DNA连接的特点三、连接反应的机理四、连接反应的温度五、影响连接反应的因素第二节DNA连接酶ligase内容提要48一、DNA连接酶的种类1.大肠杆菌DNA连接酶连接粘性末端。2.T4噬菌体DNA连接酶连接粘性末端。连接齐平末端。一、DNA连接酶的种类1.大肠杆菌DNA连接酶49二、连接反应的条件（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+二、连接反应的条件（1）必须是两条双链DNA。50三、连接反应的机理1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。2.ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。3.AMP与连接酶的赖氨酸

-氨基相连。4.AMP随后从连接酶的赖氨酸

-氨基转移到DNA一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。5.3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。三、连接反应的机理1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。51四、连接反应的温度1.最佳温度连接酶反应的最佳温度是37

C。2.实用温度但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。所以一般采用4~16

C。四、连接反应的温度1.最佳温度52五、影响连接反应的因素1.插入片段与载体的浓度比例

10~20倍。增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。2.反应温度12.5℃。一般14~16℃。五、影响连接反应的因素1.插入片段与载体的浓度比例53第三节DNA聚合酶内容提要一、常用的DNA聚合酶二、DNA聚合酶的特点三、DNA聚合酶的用途第三节DNA聚合酶内容提要54一、常用的DNA聚合酶1.大肠杆菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修饰过的T7DNA聚合酶6.逆转录酶一、常用的DNA聚合酶1.大肠杆菌DNA聚合酶55二、DNA聚合酶的特点1.共同特点把dNTPs连续地加到引物的3’-OH端。2.主要区别持续合成能力和外切酶活性不同。T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。二、DNA聚合酶的特点1.共同特点56DNA聚合酶3’

5’外切酶活性5’

3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高3.DNA聚合酶的特性比较DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率57三、各种DNA聚合酶的用途1.大肠杆菌DNA聚合酶I主要用来制备带放射性标记的DNA探针。（1）聚合酶I的性质①一条单链多肽。②具备5’

3’外切酶活性，位于N端。③具备3’

5’外切酶活性。具备5’

3’的聚合酶活性。用枯草杆菌蛋白酶处理，可以切掉N端的5’

3’外切酶活性部分，就成为Klenowfragment。三、各种DNA聚合酶的用途1.大肠杆菌DNA聚合酶I58（2）用DNA聚合酶I制备探针①核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的、带有标记的寡聚核苷酸。标记：已知序列的核酸片段显示位置：与互补的待测序列杂交（2）用DNA聚合酶I制备探针①核酸探针（probe）标59标记已知序列的核酸片断②探针的标记方式标记已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断5’

3’

标记已知序列的核酸片断②探针的标记方式标记已知序列的核酸片60③DNA聚合酶I对探针序列的标记放射性同位素标记。A.放射性同位素标记切口转移法(nicktranslation)：5’

3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA的5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。③DNA聚合酶I对探针序列的标记放射性同位素标记。61切口转移法切口切口5’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

3’

切口转移法切口切口5’5’3’3’5’3’5’621.纯化的DNA片段2.DNaseI制造单链切口4.DNAPolI进行切口转移3.一种

-32P-dNTP和dNTPs

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

32P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记1.纯化的DNA片段2.DNaseI制造单链切口4.DN632.Klenowfragment（1）Klenowfragment的性质DNAPolI经枯草杆菌蛋白酶酶切，失去5’

3’外切酶活性后的大片段(76KD）。具有5’

3’聚合酶活性和3’

5’外切酶活性。2.Klenowfragment（1）Klenowfr64（2）主要用途①3’端补平补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。5’

5’

klenowklenow（2）主要用途①3’端补平5’5’klenowklen65②DNA3’末端标记在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。②DNA3’末端标记663’隐蔽末端的片段Klenow片段补平根据末端的顺序选择一种

-32P-dNTPs末端标记的DNA

限制性内切酶切5’----G3’

3’----CTTAA5’

5’----GAA3’

3’----CTTAA5’

5’----GAATT3’

3’----CTTAA5’

5’----G3’

3’----CCTAG5’

5’----GG3’

3’----CCTAG5’

5’----GGATC3’

3’----CCTAG5’

EcoRIBamHI

-32P-dATP

-32P-dGTP25oC1h3’隐蔽末端的片段Klenow片段补平根据末端的顺序选择一种67mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenowfragment5’

3’

3’

5’

5’

3’

引物③cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenowfr683.T4DNA聚合酶（1）T4DNA聚合酶的性质①来源：从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。②酶活性：有5’

3’聚合酶活性和3’

5’外切酶活性（降解单链更快）。3.T4DNA聚合酶（1）T4DNA聚合酶的性质69③特点当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’

5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。③特点70T4DNA聚合酶5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

T4DNA聚合酶无dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’

5’

T4DNA聚合酶5’5’3’3’5’5’3’71（2）T4DNA聚合酶的用途①补平隐蔽末端②DNA3’末端标记标记末端（取代合成法）方法：用3’

5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端。再利用它的5’

3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。（2）T4DNA聚合酶的用途①补平隐蔽末端72酶切中间产生两个末端标记加入某种32P-dNTP和dNTPsT43’

5’外切酶DNA酶切片断T45’

3’聚合酶5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

内切酶切无dNTPs酶切中间产生两个末端标记加入某种32P-dNTP和dNTPs73a.放射性标记优点制作简单、高比放射性、放射自显影效果好。缺点半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、对人体有害、要求在专门实验室操作。a.放射性标记优点74b.非放射性标记i）生物素（biotin）标记：又称维生素H。结构：CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH可以与dNTP酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。也可以被生物素连接酶（biotinligase）催化与蛋白质共价结合。b.非放射性标记i）生物素（biotin）标记：75纯化的DNA片段DNaseI制造单链缺口DNAPolI进行缺口转移生物素-dTTP和dNTPs

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

生物素-dTTP生物素-dTTP利用缺口转移法将生物素掺入DNA探针中纯化的DNA片段DNaseI制造单链缺口DNAPolI进行缺76光促生物素标记生物素连接臂光敏基因探针序列探针序列生物素连接臂光敏基因+光照光促生物素标记生物素连接臂光敏基因探针序列探针序列生物素连接77ii）地高辛标记可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程。形成地高辛标记的DNA探针。地高辛的结合物是抗地高辛抗体。生物素和地高辛标记的探针有试剂盒(kit)。ii）地高辛标记可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入78图试剂盒(kit)图试剂盒(kit)79iii）偶联酶及其底物常用的两种酶：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRPO）碱性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）酶的作用：催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光（或生成有色的产物）。iii）偶联酶及其底物常用的两种酶：80图化学发光底物图化学发光底物81图HRPO和AP的显色反应底物图HRPO和AP的显色反应底物82HRPO和AP的显色反应底物HRPO和AP的显色反应底物83发光反应机理发光反应机理84iv）用非放射性标记探针检测原理探针DNA用生物素或地高辛标记。亲和素或地高辛抗体与酶偶联。酶催化一个发光或显色反应。亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。iv）用非放射性标记探针检测原理探针DNA用生物素或地高辛标85图非放射性标记探针检测原理*生物素探针序列待测基因亲和素酶底物中间产物产物发光图非放射性标记探针检测原理*生物素探针序列待测基因亲和素酶86核酸探针杂交筛选法的缺点只检测是否有外源DNA插入，而不论该DNA是否表达出产物。核酸探针杂交筛选法的缺点只检测是否有外源DNA插入，而不论该874.T7DNA聚合酶（1）来源从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的。（2）结构由两个亚基组