宫炎平片遗传毒性试验研究

宫炎平片遗传毒性试验研究

宫炎平片的主要成分是地黄、针、当归、指状毛桃和柏树。具有清热除湿、去瘀止痛、收敛止血的功效。用于湿热瘀阻所致带下病，症见小腹隐痛，经色紫暗、有块，带下色黄质稠，慢性盆腔炎见上述证候者。本试验主要研究广东罗浮山国药股份有限公司生产的宫炎平片的遗传毒性，为临床用药提供可靠依据。根据新药非临床安全性评价原则的推荐，本文选用了Ames试验(细菌回复突变试验)、CHL(中国仓鼠肺细胞株)细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验对宫炎平片进行遗传毒性研究1仪器和试剂盒1.1仪器、仪器和仪器PL203电子天平(德国METTLERTOLEDO公司)，AB104-S电子天平(德国METTLERTOLEDO公司);SW-CJ-3超净工作台(上海锦屏仪器仪表有限公司);GI7-2恒温生化培养箱，SI4-2恒温振荡培养箱(美国SHELDON公司);HVE-50自动高压灭菌锅(日本HIRAYAMA公司);SC36/32MVE液氮罐(美国MVE公司);DM500生物显微镜(德国LEICA公司);CB-150二氧化碳培养箱(德国Binder公司);ESCO安全工作台(新加坡ESCO公司);DMIL倒置显微镜(德国Leica公司);Universal32R冷冻离心机(德国Hettich公司)。1.2主要试剂和仪器宫炎平片(广东罗浮山国药股份有限公司，批号:L16A211),AcridinemutagenICR191(Sigma公司，批号:SLBH1792V),2-硝基芴(上海麦克林生化科技有限公司，批号:C10035885)，丝裂霉素C(roche，批号:107409)，叠氮化钠(Sigma-AldrichCorporation公司，批号:DH315),2-氨基芴(日本东京化工株式会社，批号:A0621)，环磷酰胺单水合物(CP,Sigma-AldrichCorporation，批号:43H0269V)。1.3药物、试剂和培养基L-组氨酸·HCl(广州齐云生物技术有限公司，批号:Ky201105),D-生物素(北京奥博星生物技术有限责任公司，批号:GD8121732)，二甲基亚砜(天津大茂化学试剂厂，批号:20160720),0.9%氯化钠注射液(广东艾希德药业有限公司，批号:150614404)，营养肉汤粉(广东环凯生物科技有限公司，批号:3105601)，琼脂粉(广东环凯生物科技有限公司，批号:3205007)，辅酶Ⅱ(NADP)(Gentihold，批号:2019/12)，辅酶Ⅱ(NADP)(Sigma,BCBQ7833V)，四环素(北京天恩泽基因科技有限公司，批号:3030612jq)，氨苄青霉素(广州齐云生物技术有限公司，批号:XLD201111)，灭菌注射用水(遂成药业，批号:1605073),McCoy’s5A培养基(CHISCIENTIF-IC，批号:20180310)，胎牛血清(CHISCIENTIFIC，批号:20180310)，胰酶(美国Gibco公司，批号:1155983)，秋水仙素(ALDRICH，批号:07016MO),Hepes(Aladdin·Chemistry-Co.Ltd，批号:27550),Giemsa染粉(一晨实业有限公司，批号:20120118)，青霉素-链霉素双抗(CHISCIENTIFIC，批号:20170313)。1.4ta98、ta102、ta153鼠伤寒沙门氏菌(TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535)来源于MoltoxMolecularToxicologyINC。1.5细胞植物中国仓鼠肺细胞株(CHL)购自广州吉妮欧生物技术有限公司，细胞来源于日本JCRB。1.6实验动物中心雌性KM小鼠，SPF级;来源:南方医科大学实验动物中心，生产许可证号:SCXK(粤)2016-0041。合格证号:44002100011496。2方法2.1ases测试2.1.1剂量设计预试验结果表明5mg/皿的GYP未观察到抑菌圈，不存在细菌毒性，故本试验设计最高剂量为5mg/皿;设5个剂量组，剂量间隔设定为2.1.2主平板和营养猪肉主平板分别制备氨苄青霉素主平板(TA97、TA98、TA100主平板)、氨苄青霉素-四环素主平板(TA102主平板)及营养肉汤琼脂主平板(TA1535主平板)。无菌条件下，挑取主平板上生长较好的少量菌落，接种于5mL营养肉汤培养液中，在振荡培养箱内(37℃，200r·min2.2chl细胞染色体畸形试验2.2.1剂量设计参考《药物遗传毒性研究技术指导原则》及OECDTG473-2014，试验选择3.2mg·mL2.2.2yp活化试验每组准备4个25cm非活化试验(-S9):每组取2瓶去除原瓶内培养液，分别加入新鲜培养液(含10%新生牛血清)4.9mL,0.1mLGYP药液(或溶媒或MMC溶液)，分别培养24,48h后收集细胞制片。活化试验(+S9):每组取另2瓶去除原瓶内培养液，加4.4mL无血清McCoys’s5A培养液、0.1mLGYP药液(或溶媒或环磷酰胺溶液)、0.5mLS9混合液，培养4h后用D-Hanks液洗涤3次，再换入新鲜培养液(含10%新生牛血清)，继续培养至24,48h后收集细胞制片。染色体标本的制备:CHL细胞分别加入不同剂量的药液中培养，并按要求制片。2.3大鼠骨髓热爱多感染红细胞微测试2.3.1剂量设计根据前期试验数据，16.0g·kg2.3.2测试步骤溶媒对照组及GYP给药组采用灌胃给药，阳性对照组采用腹腔注射给药;按0.2mL·10g2.4gyp给药gyp的生物活性使用SPSS19.0软件进行统计分析，计算每组嗜多染红细胞占总红细胞的比例[PCE比例=PCE/(PCE+NCE)]及MNPCE比率[MNPCE个数/2000×1000‰]的平均值及标准差，GYP给药各剂量组MNPCE比率及PCE比例与溶媒对照组比较，均无统计学意义(P>0.05)。3结果与讨论3.1细菌回复突变试验各组平皿均未见细菌毒性表现，显微镜下背景菌苔未见异常。显微镜下观察未见药物沉淀。溶媒对照组的细菌回复突变菌落数部分超出历史阴性对照范围，但均在该菌株正常回复突变范围内，阳性对照组细菌回复突变数显著高于溶媒对照组，与溶媒对照组比较差异存在统计学意义(P<0.05)，试验结果有效。第1次毒性试验结果:在有或无S9活化条件下，菌株TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535GYP各剂量组细菌回复突变数与溶媒对照组比较差异无统计学意义，无剂量依赖性的增加。结果为阴性。重复试验结果:在有或无S9活化条件下，菌株TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535GYP各剂量组细菌回复突变数与溶媒对照组比较差异无统计学意义，无剂量依赖性的增加。结果为阴性。3.2chl细胞染色体畸形试验3.3gyp对小鼠体重的影响3.3.1给药后24～26h采样，小鼠各剂量组给药前及采样前小鼠体重均与溶媒对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。给药后24～26h采样及46～48h采样，GYP低、中、高剂量组小鼠PCE比例及MNPCE比率与溶媒对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表7～8。给药后46～48h采样，低剂量组采样前小鼠体重低于溶媒对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，中剂量组和高剂量组及阳性对照组采样前小鼠体重与溶媒对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),GYP对小鼠给药后体重的影响无剂量依赖关系，不存在生物学意义。小鼠24～26h及46～48h采样各剂量组PCE比例及MNPCE比率与溶媒对照组比较均无统计学差异，且均在本单位历史数据范围内，判定该试验结果为阴性。4小鼠骨髓微核试验结果在本试验条件下，GYP在5000μg/皿及以下剂量，在有和无S9活化条件下，对鼠伤寒沙门氏菌菌株TA97、TA98、TA100、TA102及TA1535均无致基因突变作用。试验结果评估为阴性，即GYP不诱发鼠伤寒沙门氏菌基因突变GYP无抑制有丝分裂或诱导染色体数目畸变的能力。GYP在有或无大鼠肝微粒体酶(S9)混合物活化条件下，细胞暴露终浓度为3.2mg·mLGYP在16.00g·kg3.2.1溶媒对照组、阳性对照组试验结果符合要求，其中溶媒对照组细胞畸变率≤1.5%，阳性对照组与溶媒对照组相比，畸变细胞频率显著增加(P<0.01)，各剂量组中期细胞数达到试验要求。试验有效。3.2.2在有或无大鼠肝微粒体酶(S9)混合物活化条件下，细胞分别在暴露24h后及48h后采样，所有剂量的细胞染色体畸变率均未显著增高，且细胞染色体畸变率在历史阴性对照范围内。3.2.3染色体裂隙(g)、双着丝粒(dic)和多倍体(pol)在±S9混合液活化条件下，各剂量组畸变率均在正常范围内，GYP无抑制有丝分裂或诱导染色体数目畸变的能力，见表1～3及图1。3.3.2给药后46～48h采样，小鼠各剂量组给药前体重均与溶媒对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。低剂量组采样前体重低于溶媒对照组，存在统计学差异(P<0.05)，中剂量组和高剂量组