n-连接糖基化位点突变感染性克隆的构建及鉴定

n-连接糖基化位点突变感染性克隆的构建及鉴定

马蹄感染病毒（aav）和人免疫缺陷病毒（呼吸道感染，i-1）属于抗感染病毒科。本试验对中国EIAV强毒辽宁株(L株)及弱毒株的序列(DLV株和FDD株)进行了测定和分析,我国马传染性贫血病毒强、弱毒囊膜基因gp90之间差异很大,具有明显的规律性。在病毒基因的V3到V5区,变异规律尤为明显,且与推定的N-连接糖基化的个数密切相关。经序列分析与氨基酸比较发现,在gp90基因V3到V5区,强毒存在3个N-连接糖基化位点,对应的位置是N-191位,N-236位,N-246位而弱毒的对应区域不存在N-连接糖基化位点。为此我们将感染性克隆pLGFD3-8株进行了糖化突变,构建了含有3个N-连接糖基化突变的分子克隆,并获得相应的衍生病毒。其结果为进一步研究N-连接糖基化在我国马传贫弱毒疫苗的致弱过程中的作用奠定了基础。1材料和方法1.1材料表面1.1.1主要试剂和仪器EIAV全基因克隆质粒pLGFD3-8是基于低拷贝载体pLG338的基础上构建的EIAV驴胎皮肤细胞疫苗株全基因感染性克隆、驴胎皮肤细胞(FDD)、驴骀皮肤细胞弱毒(FDDV)、大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α、马传染性贫血病毒阳性血清和阴性血清均由哈尔滨兽医研究所慢病毒研究组提供。1.1.2主要试剂和仪器:FITC标记兔抗马IgG购自Solarbio公司;脂质体转染试剂盒(LipofectamineTM2000reagent)、鼠源反转录试剂盒(M-MLVReverseTranscriptase)购自Invitrogen公司;ReverseTranscriptaseAssayColorimetrickit购自Roche公司;前病毒DNA及病毒RNA提取试剂盒均购自Qiagen公司。低温高速离心机(SIGMA,PK-15)、PTC-100TMProgrammableThermaControllerPCR仪(PTC-100TM,MJResearch.INC)、紫外分光光度仪(UltraspecR3000,PharmaciaBiotechINC)、透射电子显微镜(JEM-1200EX,上海)、CO2恒温培养箱(WMZK-01,上海医用仪表厂)。1.1.3引用1.2循环循环,2s,6530s,6516s,7个循环利用PCR技术进行定点突变,PCR反应体系为50µl,反应条件:95℃2min;95℃30s,55℃30s,75℃16min,18个循环;75℃16min。PCR反应结束后,加入DpnI(20U),37℃消化1h,将消化后产物直接转化大肠杆菌DH5α,依据氨苄青霉素抗性初步判断是否完成突变,将初步筛选的阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。1.3rlappcr检测n-1333-t-n-33以1F、1R为引物,以pLGFD3-8为模板进行PCR。回收PCR产物2486bp的片段。将其连入pMD18-T中得到克隆pMD18-Tenv。在pMD18-Tenv上利用overlapPCR进行突变操作,以N-191-F、N-191-R为引物,获得了克隆pMD18-T-N191;以pMD18-T-N191为模板,以N-236-F、N-236-R为引物进行突变,获得了克隆pMD18-T-N191N236;以pMD18-T-N191N236为模板,以N-246-F、N-246-R为引物进行突变,获得了克隆pMD18-T-N191N236N246。用NcoⅠ、NruⅠ双酶切pMD18-T-N191N236N246,并与pLGFD3-8的NcoⅠ、NruⅠ双酶切的大片段相连获得了全基因克隆pLGN191N236N246。1.4颗粒转移和病毒遗传后代用QIAprepSpinMiniprepKit试剂盒,纯化质粒DNA至OD1.5反转录合成第一链cna细胞接毒后培养10~15d,收集培养上清140µL按照试剂盒说明书操作提取病毒RNA并用DNA酶消化去除质粒污染。以2R为引物进行反转录合成第一链cDNA。以其为模板用2F、2R为引物进行PCR,其产物大小为1347bp。PCR反应条件:95℃5min;95℃30s,49℃30s,72℃1min,30个循环;72℃10min。取5µLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。1.6马血清学检测大鼠fddv感染细胞的表达将FDD细胞传至96孔细胞培养板,24h后,接种vpLGFD3-8、vpLGN191N236N246,设立正常的FDD细胞和FDDV感染细胞作对照;37℃培养10d后,吸弃培养液,无水乙醇固定10min;0.5%PBST洗涤3次,每次3min,分别加入EIAV感染马阳性血清、马阴性血清(1100稀释),37℃孵育1h后,加入FITC标记鼠抗马IgG50µL(150稀释),37℃孵育30min;用PBST洗3遍,荧光显微镜下观察。1.7悬浮物溶液制备细胞培养上清4℃、8000×g离心10min;将上清转移至新离心管,按每2mL悬浮物中加1mLPEG溶液比例加入PEG试剂,充分混合后于冰上孵育过夜;次日,混合样品用ReverseTranscriptaseAssayColorimetrickit测定培养物中的逆转录酶活性。1.8透射电镜观察细胞在FDD细胞上接毒后,37℃培养至细胞出现明显CPE变化,即细胞皱缩,变圆,脱落,形态改变时,收取细胞制备电镜切片,用透射电镜观察其病毒颗粒。2结果和分析2.1黄鼠尾糖基化突变发生在p3-iv区2.2染色和感染的结果2.2.1转染fdd细胞将获得的全长嵌合克隆pLGN191N236N246质粒以4µg质粒转染六孔板培养FDD细胞,设立阴性对照和阳性对照(pLGFD3-8)。经过FDD细胞连续传代后病变明显,细胞变暗、圆缩或变成线状,部分细胞脱落(图1)。2.2.2plus129239转染对转染率的影响于转染后不同盲传细胞代次接种10~15d后取细胞上清进行env基因的RT-PCR检测,结果显示,在pLGN191N236N246转染组的细胞中第三代可检测到特异性扩增产物,其大小为1347bp,其它对照转染组均未发现有扩增现象。这些结果表明获得了具有感染性的全长质粒,并通过细胞转染得到了相应的衍生病毒(图2)。2.2.3间接免疫荧光检测衍生病毒感染FDD细胞10~15d后,进行间接免疫荧光检测,结果感染的FDD细胞膜表面和细胞浆内均显示强烈绿色荧光信号,而未感染FDD细胞则无荧光信号(图3)。2.2.4rt酶活性检测在FDD细胞上收集pLGN191N236N246第三代衍生病毒培养上清进行RT酶活性检测,设立阴性对照和阳性对照(pLGFD3-8)。结果表明:在FDD细胞上所显示的逆转录酶活性与其父本相似(表2)。2.3衍生病毒在猪胎皮肤细胞的电镜观察用质粒pLGN191N236N246转染获得的衍上病毒接种FDD细胞,通过透射电镜在细胞浆以及细胞间隙可观察到有大量呈球形的病毒粒子,直径约为90~120nm,具有锥形的核心,为典型的马传染性贫血病毒粒子(图4),证实pLGN191N236N246衍生毒对驴胎皮肤细胞具有感染性,可以在驴胎皮肤细胞中很好增殖。3自身遗传多样性马传染性贫血病毒(equineinfectiousanemiavirus,EIAV)、人免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirusType1HIV-1)以及猴免疫缺陷病毒(SimianimmunodeficiencyvirusSIV)等慢病毒均能逃逸宿主的免疫监控并呈持续性感染,其可能原因之一是病毒表面蛋白的高度糖基化结果近年来,尤其是1983年人类发现HIV-1以后,世界范围内广泛开展了对EIAV分子生物学的研究并取得了很多成果,尤其是反向遗传技术的发展为慢病毒的研究提供了新的思路和手段。到目前为止已经构建了多个EIAV感染性克隆用于病毒各基因功能及其与病程之间关系的研究表1为本实验所用到的引物。根据我国EIAV强、弱毒N-连接糖基化位点的差异,以EIAV弱毒感染性分子克隆pLGFD3-8为基础进行突变,最终获得了全基因克隆pLGN191N236N246。突变前后核苷酸序列变化。其中N-191位糖基化的变异包含3个碱基的突变,这3个碱基